細(xì)胞工程疑難解析

1、哈九中生物組 甄靚靚,細(xì)胞工程疑難解析,植物細(xì)胞工程,胚狀體是在植物細(xì)胞、組織或器官體外培養(yǎng)過(guò)程中，由一個(gè)或一些體細(xì)胞經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和發(fā)育過(guò)程，形成的與合子胚相類似的結(jié)構(gòu)?？蛇M(jìn)一步發(fā)育成植株。,1、胚狀體與叢芽的區(qū)別？,叢生芽-由植物器官和愈傷組織發(fā)育出來(lái)的群體叢生芽苗，大多是多細(xì)胞形成，雙極性，結(jié)構(gòu)完整，去分化容易，再分化中等。,植物細(xì)胞工程,脫分化不需要光照。 1.見(jiàn)光的話愈傷組織（高度液泡化薄壁細(xì)胞團(tuán)）會(huì)發(fā)育成篩管組織，影響其進(jìn)一步分化，且易褐化。,2、脫分化過(guò)程是否需要光？為什么菊花脫分化需要光？,2.有光時(shí)愈傷組織的形成變慢，植物細(xì)胞在光照條件下會(huì)自發(fā)進(jìn)行光合作用，光合作用的結(jié)果是生成

2、糖類，但其過(guò)程中必然需要分流出一部分物質(zhì)和能量參與進(jìn)去，從而使完成修復(fù)過(guò)程的物質(zhì)和能量的總量減少。而且較強(qiáng)光照會(huì)使植物自發(fā)分化，減慢脫分化過(guò)程。,植物細(xì)胞工程,1.同樣作為碳源和能源物質(zhì)，蔗糖較葡萄糖能更好地維持培養(yǎng)基內(nèi)的低滲環(huán)境。配制相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基，蔗糖形成的滲透壓要明顯低于葡萄糖，若采用葡萄糖作為碳源，易使植物細(xì)胞脫水而生長(zhǎng)不良。同時(shí)，植物細(xì)胞吸收蔗糖的速率要明顯慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的滲透壓可較長(zhǎng)時(shí)間地保持相對(duì)穩(wěn)定。,3、植物組織培養(yǎng)基，為何添加的是蔗糖而不是葡萄糖?,2.植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，要特別注意防止培養(yǎng)基受到微生物的污染。微生物生長(zhǎng)所需的碳源最適合的是葡萄糖，而

3、較少利用蔗糖，因此采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可在一定程度上減少微生物的污染。,3.從能源供應(yīng)來(lái)說(shuō)，相同物質(zhì)的量濃度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。,動(dòng)物細(xì)胞工程,早期胚胎培養(yǎng)是一種特殊的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。,1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、早期胚胎培養(yǎng)的關(guān)系,兩種技術(shù)所用的培養(yǎng)液從成分種類上沒(méi)有太大區(qū)別。,但早期胚胎在體外培養(yǎng)過(guò)程中，往往會(huì)停止在某一階段不再發(fā)育，這種現(xiàn)象稱為發(fā)育阻滯。發(fā)育阻滯是胚胎體外培養(yǎng)中的一個(gè)主要障礙，通過(guò)改進(jìn)培養(yǎng)液成分和建立體細(xì)胞共同培養(yǎng)體系克服。所以在早期胚胎培養(yǎng)中液要額外添加一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，例如核苷酸，維生素C等。,動(dòng)物細(xì)胞工程,從細(xì)胞接種到分離再接種培養(yǎng)的這段時(shí)間稱為一代。例如某一細(xì)胞系

4、為第40代細(xì)胞，表示該細(xì)胞系已傳代40次。 細(xì)胞的代次與細(xì)胞增殖次數(shù)（又叫細(xì)胞世代數(shù)）不同，對(duì)于傳了“一代”的細(xì)胞，在該細(xì)胞群體中有的細(xì)胞經(jīng)歷了5個(gè)細(xì)胞世代數(shù)（5次分裂）,2、原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)如何區(qū)分，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的“一代”的含義？,動(dòng)物細(xì)胞工程,這與病毒的結(jié)構(gòu)有關(guān)，較復(fù)雜的病毒外邊還有由脂質(zhì)和糖蛋白構(gòu)成包膜（被摸）。 植物病毒不能介導(dǎo)植物細(xì)胞融合的原因，就是絕大部分植物病毒缺少被膜這個(gè)結(jié)構(gòu)。所以融合就無(wú)從談起了。那少數(shù)有被膜的病毒，又缺乏必需的糖蛋白，目前尚沒(méi)有應(yīng)用成功的先例。 （選修三52頁(yè)）,3、植物細(xì)胞融合為什么不用滅活病毒作為誘導(dǎo)劑？,動(dòng)物細(xì)胞工程,4、細(xì)胞融合過(guò)程中PEG的作用

5、,動(dòng)物細(xì)胞工程,注入核常用于胚胎細(xì)胞核移植 注入完整的體細(xì)胞常用于體細(xì)胞核移植,5、核移植時(shí)，注入核和完整體細(xì)胞的區(qū)別,動(dòng)物細(xì)胞工程,6、單克隆抗體制備過(guò)程,獲取B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞,單克隆抗體制備過(guò)程,實(shí)際操作中B淋巴細(xì)胞用的是無(wú)菌操作取出小鼠脾臟，剪碎，研磨后獲取的將脾臟細(xì)胞懸液。 骨髓瘤細(xì)胞采用的是體外培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞或體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤分離骨髓瘤細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。,細(xì)胞融合,分泌抗體 不能無(wú)限增殖,不分泌抗體 能無(wú)限增殖,B淋巴細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞,分泌抗體 能無(wú)限增殖,雜交瘤細(xì)胞,融合后產(chǎn)生的不同細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞,雜交瘤細(xì)胞,脾細(xì)胞X脾細(xì)胞,骨髓瘤

6、細(xì)胞X骨髓瘤細(xì)胞,脾細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞,目標(biāo)細(xì)胞,怎樣篩選？,DNA合成的兩條途徑,堿基和核苷,糖+氨基酸,HGPRT酶 TK酶,（應(yīng)急途徑）,（主要途徑）,核苷酸,DNA,HAT選擇培養(yǎng)液由黃嘌呤、氨基嘌呤和胸腺嘧啶三種成分組成，三種成分簡(jiǎn)稱HAT。氨基嘌呤有阻斷DNA主要合成途徑的作用。,HAT選擇培養(yǎng)液的作用,堿基和核苷,糖+氨基酸,HGPRT酶 TK酶,氨基嘌呤阻斷,（應(yīng)急途徑）,（主要途徑）,核苷酸,DNA,在HAT培養(yǎng)基中， 用來(lái)制備雜交瘤細(xì)胞的骨髓瘤 細(xì)胞為HGPRT-和TK-細(xì)胞。不 含有HGPRT酶和TK酶，失去 了通過(guò)應(yīng)急途徑合成DNA的能 力。 HAT選擇培養(yǎng)液對(duì)淋巴細(xì)胞無(wú)

7、 影響，但淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)條件 下不能無(wú)限增殖。 骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合成的 雜交瘤細(xì)胞，繼承了脾細(xì)胞合 成HGPRT酶和TK酶的能力。,被淘汰,生長(zhǎng)存活,此時(shí)篩選出的雜交瘤細(xì)胞有多種類型，包括抗體分泌細(xì)胞和抗體非分泌細(xì)胞，抗體分泌細(xì)胞數(shù)量非常少，大約只有1%左右，其中還包括所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無(wú)關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。 因此，接下來(lái)要對(duì)抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞進(jìn)行篩選。,經(jīng)過(guò)單一抗體篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞即可進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，因?yàn)槿绻贿M(jìn)行克隆化，當(dāng)陽(yáng)性孔有非抗體分泌型的雜交瘤時(shí)，非抗體分泌型的雜交瘤由于生長(zhǎng)速度更快，將會(huì)占主導(dǎo)生長(zhǎng)，最終很難分離出目標(biāo)雜交瘤以至丟失。另外雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體