副溶血弧菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制規(guī)章制度

1、副溶血弧菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制規(guī)章制度副溶血弧菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制 本文關(guān)鍵詞：耐藥，弧菌，溶血，現(xiàn)狀及，機(jī)制副溶血弧菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制 本文簡介：摘要：副溶血弧菌是一種重要的食源性疾病致病菌，其引起的感染已成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和臨床上抗生素使用不規(guī)范，會(huì)直接導(dǎo)致或加劇副溶血弧菌耐藥。一方面，耐藥菌可通過食物鏈進(jìn)入人體，給臨床治療副溶血弧菌感染帶來巨大挑戰(zhàn)；另一方面，耐藥菌中的可移動(dòng)遺傳元件可以將耐藥基因傳遞給其他細(xì)菌，從而副溶血弧菌耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制 本文內(nèi)容：摘要：副溶血弧菌是一種重要的食源性疾病致病菌，其引起的感染已成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和臨床上抗生

2、素使用不規(guī)范，會(huì)直接導(dǎo)致或加劇副溶血弧菌耐藥。一方面，耐藥菌可通過食物鏈進(jìn)入人體，給臨床治療副溶血弧菌感染帶來巨大挑戰(zhàn)；另一方面，耐藥菌中的可移動(dòng)遺傳元件可以將耐藥基因傳遞給其他細(xì)菌，從而產(chǎn)生更大的威脅。本文主要概述了副溶血弧菌的耐藥現(xiàn)狀、耐藥機(jī)制及相應(yīng)的耐藥檢測方法，為副溶血弧菌耐藥產(chǎn)生、傳播及控制提供參考。關(guān)鍵詞：副溶血弧菌； 耐藥； 現(xiàn)狀； 機(jī)制； 檢測；副溶血弧菌是一種嗜鹽性的革蘭陰性菌，廣泛存在于水體、水底沉積物和水生動(dòng)物體內(nèi)。副溶血弧菌感染者可出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)敗血癥1.副溶血弧菌污染是食用水產(chǎn)品引起食物中毒的主要原因，大部分病例發(fā)生于8-10月。副溶血

3、弧菌感染暴發(fā)在全球很多國家和地區(qū)常有報(bào)道，如美國、法國、新西蘭等，也是亞洲一些國家和地區(qū)細(xì)菌性食源性疾病的首要致病菌2-4.在中國，自_年以來，報(bào)告的副溶血弧菌感染引起的食源性疾病暴發(fā)數(shù)量呈逐年增高的趨勢，副溶血弧菌逐漸成為中國食源性疾病的主要致病菌5.同時(shí)，副溶血弧菌在水產(chǎn)品中的檢出率也呈增高趨勢，并逐漸打破地域界限，由沿海地區(qū)向內(nèi)陸地區(qū)播散。由于抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)和臨床治療中的不規(guī)范使用，細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)重，多重耐藥菌株的出現(xiàn)使得常規(guī)抗生素失去療效，給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)。據(jù)估計(jì)，美國每年耐藥菌感染病例超過200萬例，死亡約2.30萬例6.事實(shí)上，除了部分嚴(yán)重的病例外，大部分副溶

4、血弧菌感染是自限性的，不需要應(yīng)用抗生素。本文主要綜述了副溶血弧菌的耐藥現(xiàn)狀、耐藥機(jī)制及相關(guān)檢測方法，以期為副溶血弧菌耐藥性相關(guān)研究的深入開展提供參考資料，促進(jìn)抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)以及臨床治療中的合理使用。1 副溶血弧菌的耐藥現(xiàn)狀美國自1978年起就發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌對(duì)氨芐西林有很高的耐藥率7,目前，許多國家和地區(qū)分離的副溶血弧菌都普遍對(duì)氨芐西林耐藥。在環(huán)境和食品分離株中多耐藥現(xiàn)象很普遍，這些菌株對(duì)-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等多種抗生素均有不同程度耐藥，但在臨床分離株中多耐藥現(xiàn)象并不嚴(yán)重。1.1 環(huán)境和食品分離株的耐藥現(xiàn)狀從全球范圍看，不同地區(qū)環(huán)境和食品分離的副溶血弧菌耐藥譜存在差異，這

5、與不同地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖模式等方面的原因相關(guān)。此外有研究發(fā)現(xiàn)，從水底沉積物分離的菌株抗生素耐藥率明顯高于從潮水和洪水中分離菌株的耐藥率8.在大西洋海岸，美國馬里蘭州沿海海灣分離的副溶血弧菌，對(duì)青霉素類抗生素的耐藥率很高，其中青霉素耐藥率68.00%,氨芐西林53.00%,對(duì)哌拉西林和鏈霉素的耐藥率較低，為4.00%,有96.0%的分離株對(duì)氯霉素中度耐藥9.大西洋東海岸的南非東開普省也有藥敏數(shù)據(jù)顯示，副溶血弧菌分離株對(duì)氨芐西林均耐藥，同時(shí)對(duì)治療弧菌常用抗生素如鏈霉素、四環(huán)素、卡那霉素等也有不同程度的耐藥10.全世界的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主要集中在發(fā)展中國家，尤其是亞洲地區(qū)。亞洲地區(qū)水產(chǎn)品中分離到的副溶

6、血弧菌也經(jīng)常有多耐藥的報(bào)道：印度西南部蝦養(yǎng)殖場中分離到的120株副溶血弧菌均為多耐藥菌株，對(duì)常見的-內(nèi)酰胺類（氨芐西林）、磺胺類（磺胺甲惡唑）、喹諾酮類（恩諾沙星）藥物有不同程度的耐藥11.Letchumanan等人發(fā)現(xiàn)馬來西亞的市售貝類 和蝦類分離的副溶血弧菌大部分為多耐藥菌株12-13,對(duì)治療弧菌感染常用的二線和三線藥物均耐藥，其中對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，為80%以上，其次為阿米卡星、卡那霉素等氨基糖苷類抗生素，對(duì)三代頭孢菌素也有一定程度的耐藥。另有研究發(fā)現(xiàn)不同水產(chǎn)品分離到的副溶血弧菌耐藥狀況也不同，香蕉蝦中分離的副溶血弧菌多耐藥指數(shù)明顯高于紅蝦；斑節(jié)對(duì)蝦中分離的副溶血弧菌耐藥率明顯高于白

7、蝦、凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦等其他種屬的蝦14 .在中國，上海市售蝦對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)99%,其次為鏈霉素（45.30%）、利福平（38.30 %）、壯觀霉素（25.50 %），所有菌株均對(duì)四環(huán)素和氯霉素敏感14.華北地區(qū)市售水產(chǎn)品中分離到的副溶血弧菌對(duì)鏈霉素的耐藥率最高，為 86.20%,其次為氨芐西林（49.60%）、頭孢唑林（43.50%）、頭孢噻吩（35.90%），對(duì)阿奇霉素和氯霉素均敏感；其中從魚樣本中分離到一株副溶血弧菌對(duì)7種抗生素（鏈霉素、頭孢噻吩、頭孢唑林、氨芐西林、卡那霉素、復(fù)方磺胺甲惡唑、四環(huán)素）耐藥15.除了水產(chǎn)品之外，副溶血弧菌在其他肉食（雞肉、牛肉、豬肉）的檢出率也很

8、高16.中國地區(qū)市售即食食品中分離到對(duì)五種抗生素耐藥多耐藥菌株均來自熟肉食品，分離到的副溶血弧菌耐藥譜顯示：對(duì)鏈霉素耐藥率最高，為89.70%,其次是氨芐西林（51.30%）、頭孢唑啉（51.30%）、頭孢噻吩（41.00%）和卡那霉素（41.00%）；沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)阿奇霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素耐藥的菌株17.1.2 臨床分離株的耐藥現(xiàn)狀Pazhani等18對(duì)印度15家醫(yī)院的腹瀉病人進(jìn)行了為期12年的監(jiān)測，分離到178株副溶血弧菌藥敏結(jié)果顯示：氨芐西林的耐藥率最高，為98.00%;其次是鏈霉素為86.00%.有一株非大流行菌株對(duì)復(fù)方磺胺甲惡唑、萘啶酸、四環(huán)素、氯霉素、氨芐西林、鏈霉素

9、等多種抗生素耐藥；另有三株菌對(duì)所有11種抗生素均敏感。 -年，從中國東南部8家醫(yī)院門診急性腹瀉病人的糞便樣本中分離到的501株副溶血弧菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，氨芐西林的耐藥率最高，為87.10%,其次是頭孢西?。?6.90%）和頭孢唑林（43.70%）；95%以上的菌株對(duì)其他9種常用抗生素敏感19.目前，有一些研究對(duì)副溶血弧菌臨床分離株、環(huán)境分離株、食品分離株的耐藥情況進(jìn)行了比較研究。Tai等20 在越南南部多個(gè)城市收集433份急性腹瀉患者糞便樣本、233份水樣、85份食品樣本，共分離到130株副溶血弧菌，分離率分別為8.30%、20.10%和40.00%.藥敏結(jié)果顯示氨芐西林耐藥率為45.40%,大

10、部分副溶血弧菌對(duì)四環(huán)素（90.80%）、氯霉素（97.70%）、環(huán)丙沙星（100.00%）敏感。Ottaviani等21對(duì)意大利地中海的貝類樣本和臨床樣本中分離的副溶血弧菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)96.30%的菌株為多耐藥，不同來源的菌株多耐藥指數(shù)沒有明顯差別；分析發(fā)現(xiàn)，臨床菌株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率遠(yuǎn)高于環(huán)境菌株，其它藥物的耐藥率沒有明顯差別，詳見表1.有研究對(duì)中國副溶血弧菌流行株進(jìn)行系統(tǒng)綜述，共篩出290株臨床和環(huán)境株。發(fā)現(xiàn)目前中國的大流行株在耐藥譜方面無明顯差異，對(duì)氨芐西林的耐藥率較高，對(duì)頭孢唑林、阿米卡星、頭孢呋辛等氨基糖苷類抗生素中度耐藥，對(duì)其他大部分常用抗生素如美羅培南、四環(huán)素、左氧氟沙

11、星等比較敏感，其中未發(fā)現(xiàn)多耐藥菌株22.2 副溶血弧菌耐藥機(jī)制2.1固有耐藥固有耐藥指細(xì)菌對(duì)某些抗生素的天然不敏感，主要由染色體基因介導(dǎo)，一般比較穩(wěn)定。固有耐藥的產(chǎn)生主要包括兩個(gè)方面，一是細(xì)菌缺乏對(duì)特定抗生素的易感靶位；二是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致副溶血弧菌能天然抑制萬古霉素等糖肽類抗生素進(jìn)入細(xì)胞23.2.2 獲得耐藥獲得耐藥是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和擴(kuò)散的主要原因。獲得耐藥指細(xì)菌在抗生素作用下產(chǎn)生了自身突變，耐藥基因通過接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)換等方式水平轉(zhuǎn)移，使細(xì)菌捕獲或缺失某些遺傳信息從而產(chǎn)生耐藥性。耐藥基因的轉(zhuǎn)移和傳播主要由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)遺傳元件介導(dǎo)24-25.副溶血弧菌獲得耐藥產(chǎn)生的生化機(jī)制

12、主要概括為以下幾方面：通過增加藥物排出或減少藥物滲入，減少抗生素到達(dá)靶細(xì)胞；通過基因突變或修飾，改變與抗生素結(jié)合的靶位，使抗生素不能發(fā)揮作用；通過產(chǎn)生耐藥酶，水解、轉(zhuǎn)移或滅活抗生素23.2.2.1 減少抗生素到達(dá)靶細(xì)胞2.2.1.1 細(xì)胞膜的通透性細(xì)菌的細(xì)胞膜是阻礙抗生素進(jìn)入細(xì)胞的天然屏障。革蘭陰性菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)通透性較差，因此副溶血弧菌等革蘭陰性菌對(duì)萬古霉素等抗生素天然不敏感。2.2.1.2 外排泵作用外排泵是一類膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能將抗生素等物質(zhì)有選擇性地或無選擇性地排出到細(xì)胞外。主要的藥物外排泵系統(tǒng)包括四類：主要協(xié)助蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)超家族（MFS）、小多耐藥蛋白超家族（SMR）、耐藥結(jié)節(jié)分化超家族（R

13、ND）、 ATP結(jié)合盒超家族（ABC）26.所有細(xì)菌都攜帶編碼多藥外排泵的基因23,有的位于質(zhì)粒上，可以在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移。多藥外排泵在細(xì)菌多重耐藥性方面發(fā)揮了重要作用，是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性的主要機(jī)制27.從現(xiàn)有的基因組序列獲得的數(shù)據(jù)估計(jì)，副溶血弧菌中含有約50種多藥外排泵，其中最主要的是NorM蛋白，這是一種諾氟沙星外排蛋白，含有許多疏水殘基和12個(gè)跨膜區(qū)域28,屬于多藥和毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（Multi Antimicrobial Extrusion,MATE）這一新型家族成員，MATE家族可以保護(hù)細(xì)菌不與藥物及其它毒物結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌的NorM蛋白是一種Na+驅(qū)動(dòng)的反向轉(zhuǎn)運(yùn)的

14、多藥外排泵，該蛋白跨膜區(qū)域上的酸性氨基酸殘基Asp32、Glu251和Asp367參與藥物外排的過程，介導(dǎo)了副溶血弧菌對(duì)諾氟沙星和卡那霉素的耐藥29 .2.2.1.3 生物膜系統(tǒng)生物膜是細(xì)菌附著在固體表面生長，并形成由菌體及其分泌的基質(zhì)包裹在一起的膜狀復(fù)合物。生物膜形成后，細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性、耐藥性及抵抗宿主免疫細(xì)胞的吞噬作用明顯增強(qiáng)。細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制并未完全闡明。大部分觀點(diǎn)認(rèn)為：一方面，細(xì)菌形成的生物膜可以構(gòu)成一個(gè)外部屏障，限制或減緩抗生素的滲入30;另一方面，細(xì)菌在生物膜狀態(tài)下，類整合酶基因表達(dá)上調(diào)31,突變率提高，這種相互接觸更為緊密的環(huán)境導(dǎo)致菌體間質(zhì)粒的接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)等頻率也隨之增高，這

15、為菌體間耐藥基因的擴(kuò)散提供了有利條件。致病性副溶血弧菌能形成生物膜，從而與載體進(jìn)行特異性的結(jié)合。生物膜的形成與菌濃度、溫度、NaCl濃度、pH值等因素密切相關(guān)，Ca2+能促進(jìn)副溶血弧菌形成生物膜。有研究發(fā)現(xiàn)，耐藥較高的弧菌形成生物膜的能力也相對(duì)較強(qiáng)32,但關(guān)于副溶血弧菌生物膜與耐藥性之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。2.2.2 靶位基因突變細(xì)菌與抗生素結(jié)合的靶位基因突變，導(dǎo)致抗生素不能產(chǎn)生作用，這是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因。目前對(duì)該機(jī)制研究最多的是喹諾酮類藥物的靶位基因突變。細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥主要是由于編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因突變所致33.DNA旋轉(zhuǎn)酶由GyrA和GyrB亞基組成，分

16、別由gyrA和gyrB基因編碼，拓?fù)洚悩?gòu)酶由ParC和ParE亞基組成，分別由parC和parE基因編碼。細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥主要與gyrA和parC基因突變有關(guān)34 .大部分喹諾酮類耐藥突變發(fā)生于gyrA基因序列上67-106位氨基酸殘基之間，稱為喹諾酮耐藥決定區(qū)（Quinolone Resistance-Determining Region,QRDR）35.研究表明，大部分對(duì)環(huán)丙沙星等喹諾酮類藥物耐藥的副溶血弧菌，其gyrA基因83位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?；?duì)于耐藥水平高的菌株，其parC基因也會(huì)發(fā)生點(diǎn)突變，第85位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?6.2.2.3 耐藥酶細(xì)菌可以通過

17、產(chǎn)生鈍化酶或滅活酶來破壞或滅活抗生素的活性。細(xì)菌產(chǎn)生的耐藥酶主要有-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和大環(huán)內(nèi)酯類-林克霉素類-鏈陽菌素類鈍化酶?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌對(duì)？內(nèi)酰胺類（氨芐西林、頭孢菌素）、氨基糖苷類（卡那霉素）及氯霉素類（氯霉素）抗生素的耐藥主要通過-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶等耐藥酶類介導(dǎo)37.目前對(duì)副溶血弧菌該機(jī)制研究最多的是其產(chǎn)生的-內(nèi)酰胺酶。-內(nèi)酰胺酶能夠特異性地打開分子結(jié)構(gòu)中的-內(nèi)酰胺環(huán)，使-內(nèi)酰胺類抗生素失去抗菌活性。研究表明，在副溶血弧菌中存在組氨酸激酶/應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白-VbrK/VbrR,可以控制-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)，介導(dǎo)副溶血弧菌對(duì)-

18、內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥38.Ruichao Li等16發(fā)現(xiàn)攜帶有編碼-內(nèi)酰胺酶基因（blaTEM-1、blaPER-1、blaCMY-2、blaVEB-2等）的可結(jié)合質(zhì)粒介導(dǎo)了副溶血弧菌對(duì)廣譜頭孢菌素的耐藥。3 副溶血弧菌耐藥性檢測3.1耐藥表型檢測細(xì)菌耐藥表型檢測的常規(guī)方法為藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)的方法主要包括紙片擴(kuò)散法、肉湯稀釋法、濃度梯度法和自動(dòng)化檢測系統(tǒng)39.藥敏結(jié)果的判定是依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）弧菌屬的標(biāo)準(zhǔn)M4540.紙片擴(kuò)散法不需要特殊的儀器，具有抗生素選擇靈活、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，是

19、副溶血弧菌藥敏試驗(yàn)中最常采用的一種方法，由于副溶血弧菌是嗜鹽菌，因此進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的比濁液中應(yīng)添加適量的NaCl,一般為0.85%.肉湯稀釋法能夠獲得最小抑菌濃度（Minimal Inhibition Concentration,MIC），商品化的藥敏板具有操作方便、可重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。濃度梯度法是通過抗生素在瓊脂板上擴(kuò)散成濃度梯度來定量測量抗生素敏感性，商品化的方法為E-test法，操作方便，可作為副溶血弧菌耐藥模糊結(jié)果的確認(rèn)。臨床常用于檢測副溶血弧菌的自動(dòng)化儀器系統(tǒng)主要為Vitek系統(tǒng)和BD Phoenix系統(tǒng)，可以全自動(dòng)地對(duì)耐藥結(jié)果進(jìn)行定性和定量的分析，具有簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)。3.2 耐藥基因檢測在藥敏試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，如果能知道細(xì)菌是否攜帶有耐藥基因，能更好地預(yù)測藥物治療的效果，解釋耐藥機(jī)制。常用的細(xì)菌耐藥基因檢測的方法包括PCR法、DNA探針法、基因芯片技術(shù)、飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF MS）、全基因組測序等41.這些檢測方法具有快速、簡便、靈敏度和特異度高等特點(diǎn)，同時(shí)可以結(jié)合基因克隆和測序來分析耐藥基因的結(jié)構(gòu)及突變情況。目前，在副溶血弧菌中已經(jīng)檢測到多種耐藥基因，主要包括：-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCM