毛細(xì)管電泳技術(shù)在檢測分析中的應(yīng)用

1、毛細(xì)管電泳技術(shù)及其在檢測分析中的應(yīng)用摘要： 毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)作為現(xiàn)今一種主要的分析技術(shù)，憑借其高效、靈敏、快速、設(shè)備簡單、廣泛適用性等特點，廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。本文簡要概述了CE技術(shù)的原理及特點，并簡述了它在環(huán)境分析、食品分析、藥物分析、生物大分子分析等各個領(lǐng)域的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：毛細(xì)管電泳；分析；應(yīng)用1. 毛細(xì)管電泳技術(shù)簡介1.1 產(chǎn)生與發(fā)展毛細(xì)管電泳技術(shù)（Capillary Electrophoresis, CE）是一種在電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種現(xiàn)代分離技術(shù)。電泳技術(shù)作為一種分離技術(shù)已有近百年歷史，1937 年A.Tiselius 首先提出：傳統(tǒng)電泳最大的局限是難以克服由高電壓引起的焦

2、耳熱。1967年，Hjerten 最先提出了毛細(xì)管電泳的雛形，即在直徑為3mm的毛細(xì)管中做自由溶液的區(qū)帶電泳。但他并沒有完全克服傳統(tǒng)電泳的弊端。直至1981年Jorgenson和Lukacs提出在75m內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離, 這時現(xiàn)代毛細(xì)管電泳技術(shù)真正產(chǎn)生。1984 年Terabe將膠束引入毛細(xì)管電泳，開創(chuàng)了毛細(xì)管電泳的重要分支：膠束電動毛細(xì)管色譜（MEKC）。1987年Hjerten 等把傳統(tǒng)的等電聚焦過程轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行。同年，Cohen 發(fā)表了毛細(xì)管凝膠電泳的工作。近年來，將液相色譜的固定相引入毛細(xì)管電泳中，又發(fā)展了電色譜，擴大了電泳的應(yīng)用范圍。毛細(xì)管電泳技術(shù)兼有高壓電泳及高

3、效液相色譜等優(yōu)點，其突出特點是：（1）所需樣品量少、儀器簡單、操作簡便。（2）分析速度快，分離效率高，分辨率高，靈敏度高。（3）操作模式多，開發(fā)分析方法容易。（4）實驗成本低，消耗少。（5）應(yīng)用范圍極廣。自1988年出現(xiàn)了第一批毛細(xì)管電泳商品儀器，短短幾年內(nèi), 由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學(xué)各領(lǐng)域中對多肽、蛋白質(zhì)(包括酶，抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求, 得到了迅速的發(fā)展。1.2 毛細(xì)管電泳技術(shù)的簡單原理毛細(xì)管電泳的基本裝置是一根充滿電泳緩沖液的毛細(xì)管（如圖1），和與毛細(xì)管兩端相連的兩個小瓶。微量樣品從毛細(xì)管的一端通過“壓力”或“電遷移”進(jìn)入毛細(xì)管。電泳時，與

4、高壓電源連接的兩個電極分別浸人毛細(xì)管兩端小瓶的緩沖液中。樣品朝與自身所帶電荷極性相反的電極方向泳動。各組分因其分子大小、所帶電荷數(shù)、等電點等性質(zhì)的不同而遷移速率不同，依次移動至毛細(xì)管輸出端附近的光檢測器，檢測、記錄吸光度，并在屏幕上以遷移時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)將各組分以吸收峰的形式動態(tài)直觀地記錄下來。圖 1圖 21.3 毛細(xì)管電泳技術(shù)的分離模式（1）毛細(xì)管區(qū)帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis, CZE）用以分析帶電溶質(zhì)。為了降低電滲流和吸附現(xiàn)象，可將毛細(xì)管內(nèi)壁涂層。CZE 是最基本也是最常見的一種操作模式，應(yīng)用范圍最廣，可用于多種蛋白質(zhì)、肽、氨基酸的分析

5、。（2）膠束電動毛細(xì)管色譜（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC）在緩沖液中加入離子型表面活性劑如十二烷基硫酸納，形成膠束，被分離物質(zhì)在水和膠束相（準(zhǔn)固定相）之間發(fā)生分配并隨電滲流在毛細(xì)管內(nèi)遷移，達(dá)到分離。MECC 是唯一一種既能用于中性物質(zhì)的分離又能分離帶電組分的CE 模式。（3）毛細(xì)管凝膠電泳（Capillary Gel Electrophoresis, CGE）在毛細(xì)管中裝入單體，引發(fā)聚合形成凝膠。CGE 分凝膠和無膠篩分兩類，主要用于DNA、RNA 片段分離和順序、PCR產(chǎn)物分析及蛋白質(zhì)等大分子化合物的檢測。（4）

6、親和毛細(xì)管電泳，在毛細(xì)管內(nèi)壁涂布或在凝膠中加入親和配基，以親和力的不同達(dá)到分離。可用于研究抗原-抗體或配體-受體等特異性相互作用。（5）毛細(xì)管電色譜，（Capillary Electrochromatography, CEC）是將高效液相色譜（HPLC）的固定相填充到毛細(xì)管中，或在毛細(xì)管內(nèi)壁涂布固定相，以電滲流為流動相驅(qū)動力的色譜過程。此模式兼具電泳和液相色譜的模式。（6）毛細(xì)管等電聚焦電泳（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF）是通過內(nèi)壁涂層使電滲流減到最小，在兩個電極槽分別裝酸和堿，加高電壓后，在毛細(xì)管內(nèi)壁建立pH 梯度，溶質(zhì)在毛細(xì)管中遷移至各自的等電點

7、，形成明顯區(qū)帶。聚焦后，用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH 值使溶質(zhì)通過檢測器。CIEF 已經(jīng)成功用于測定蛋白質(zhì)等電點，分離異構(gòu)體等方面。（7）毛細(xì)管等速電泳，（Capillary isotachophoresis, CITP）采用先導(dǎo)電解質(zhì)和后繼電解質(zhì)，使溶質(zhì)按其電泳淌度不同得以分離。（8）CE/MS 聯(lián)用，CE 的高效分離與MS 的高鑒定能力結(jié)合，成為微量生物樣品，尤其是多肽、蛋白質(zhì)分離分析的強有力工具。可提供分子量及結(jié)構(gòu)信息，適于目標(biāo)化合物分析或窄質(zhì)量范圍內(nèi)掃描分析，如多環(huán)芳香碳?xì)浠衔铮≒AH）、寡聚核苷酸分析等。2. 毛細(xì)管電泳技術(shù)的應(yīng)用毛細(xì)管電泳（CE）由于具有著上述獨特優(yōu)點，

8、現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析、食品分析、藥物分析、生化分析等領(lǐng)域。分析的對象可以是離子、小分子、生物大分子乃至高分子、粒子和活體單個細(xì)胞。含量測定范圍可從常量到微量乃至幾個分子的測定。應(yīng)用極其廣泛。2.1 環(huán)境分析毛細(xì)管電泳在環(huán)境分析中主要應(yīng)用于水樣中陽離子和陰離子的分析、多環(huán)芳烴的分析、農(nóng)藥殘留量的分析、多氯聯(lián)苯的分析、金屬離子和無機陰離子的分析、DNA 加合物的測定、酚類化合物分析等幾個方面。以金屬離子分析為例。傳統(tǒng)的金屬離子儀器分析方法包括原子吸收法、離子色譜法、液相色譜法、電化學(xué)法和質(zhì)譜法。上述方法中有的需要消耗大量的溶劑和時間，有的預(yù)處理方法復(fù)雜，有時甚至?xí)斐纱郎y成分在預(yù)處理過程中嚴(yán)重

9、受損。毛細(xì)管電泳（CE）因其溶劑消耗量小、分離效率高逐漸受到重視。石美，高慶宇等人開發(fā)了一種將毛細(xì)管電泳用于含水溶性金屬離子樣品分離檢測的間接紫外法。在8.5min內(nèi)實現(xiàn)K+，Ba2+，Ca2+，Na+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Cd2+，Li+ 和Cu2+10種金屬離子的基線分離，各金屬離子的檢測限、線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.010.21mg/L，0.0660mg/L和0.50.9998之間，標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率為9.64%102.6%，5次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8%4.5%之間。并證明該法可以用于這些金屬離子在復(fù)雜基質(zhì)中的常規(guī)檢測。2.2 食品分析毛細(xì)管電泳在食品分析中主要應(yīng)

10、用于蛋白質(zhì)、氨基酸、生物胺、維生素、碳水化合物、無機離子、有機酸等的含量測定以及食品添加劑、殘留農(nóng)藥、生物毒素的分析。王茜和王廣增對毛細(xì)管電泳技術(shù)在食品添加劑分析中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，例如：毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)可分離和測定濃縮果汁、軟飲料、果醬、蠔油和人造黃油中的山梨酸和苯甲酸，檢測限約0.06 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.9%-4%。為了減少基質(zhì)干擾，在分離之前用固相萃取柱(SPE)對樣品進(jìn)行預(yù)處理，檢測限低于0.5 m/L。唐吉軍等人用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)從隨機寡核苷酸文庫中篩選獲得特異識別蓖麻毒素靶分子的適配子，將毛細(xì)管電泳技術(shù)作為分離手段引入到SELEX

11、 篩選中，利用毛細(xì)管電泳高效的分離能力使得篩選周期大大縮短。2.3 藥物分析從1987年首次將毛細(xì)管電泳技術(shù)用于藥物分析以來，已有約200篇論文報道CE用于幾百種藥物及各種劑型中主藥成分分析、相關(guān)雜質(zhì)檢測、純度檢查、無機離子含量測定及定性鑒別等藥物常規(guī)分析。進(jìn)來對于中藥成分分析以及手性對映體分離分析越來越成為關(guān)注的焦點。對中藥及其制劑的成分分析目前較常用的方法為毛細(xì)管區(qū)帶電泳和毛細(xì)管膠束電動色譜法。中藥成分一般采用水煮或用醇等有機溶劑提取，其萃取液中常見的藥效成分為生物堿、黃酮、香豆素、有機酸及甙類。現(xiàn)已有關(guān)于芍藥、人參、黃芩、黃連、黃柏、麻黃、大黃、甘草等中藥材以及葛根湯、小柴胡湯、加味逍遙

12、散等幾十種中藥復(fù)方及其制劑中某些藥效成分分析的報道。手性對映體分離有巨大的應(yīng)用價值，已引起世界各國普遍關(guān)注，成為現(xiàn)代高科技的一個重要領(lǐng)域。我國已將其列為自然科學(xué)基金資助的重大項目。由于CE的分離效率高，分離模式多和分析時間短的優(yōu)點。所以CE分離手性對映體的應(yīng)用發(fā)展得很快。例如第八屆國際高效毛細(xì)管電泳學(xué)術(shù)年會共有362篇論文，其中手性對映體分離就有31篇，占8.6%?？捎肅E間接分析方法進(jìn)行手性對映體分離，即將手性對映體和某些試劑反應(yīng)后利用兩對映體產(chǎn)物間微小差別用CE分離。但此法存在許多問題。用CE直接分離手性對映體是發(fā)展方向。在機理上已提出手性對映體分離的數(shù)學(xué)模型?？捎?種模式即CZE、MEC

13、C、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管電色譜和毛細(xì)管等速電泳等進(jìn)行分離。常用的手性選擇劑有環(huán)糊精、冠醚、手性選擇性金屬絡(luò)合物、膽酸鹽、手性混合膠束、蛋白和糖等。國際高效毛細(xì)管電泳學(xué)術(shù)年會會議論文除介紹一些手性對映體分離實例外，主要集中在機理研究。如手性分離中表面反應(yīng)的機理、結(jié)合常數(shù)的測定、背景電解質(zhì)和外加有機溶劑的影響以及MECC中表面活性劑結(jié)構(gòu)、溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對分離的影響等。 如Vigh等基于多種平衡推導(dǎo)出的計算公式，可研究PH值，手性選擇劑濃度，電滲流等對分離及選擇性的影響。2.4 生物大分子分析CE主要在生物大分子方面主要應(yīng)用于核酸分析、蛋白質(zhì)分析、糖類分析幾個方面。其中最為熱門的要數(shù)對于DNA的分析。C

14、E技術(shù)運用于DNA分析最首要的優(yōu)點是可以實現(xiàn)微量DNA的檢測。核酸是基本遺傳物質(zhì)。用MECC在40min以內(nèi)分離出14種核酸成分。采用動態(tài)pH梯度將CZE擴展到具有不同pK值混合物，分離出11種嘌呤和嘧啶混合物。從水解的RNA中用CZE在5min以內(nèi)分離出4個核糖核苷酸異構(gòu)體。當(dāng)使用LIF檢測器時，它可以從幾十納克的固相硅膠樹脂中檢測到所吸附的幾個納克或幾個皮克的DNA。因此，從若干白細(xì)胞、癌細(xì)胞或幾微升血液中提取的DNA可直接為CE所定量，用于PCR擴增 。當(dāng)CE與PCR微型裝置相連時，可檢測到2個拷貝的起始模板經(jīng)20次循環(huán)后的擴增產(chǎn)物，這也是所有報道中CE的微量檢測極限。而且，當(dāng)使用聚丙烯

15、酰胺填充的毛細(xì)管、綠色氦/氖激光光源時，利用內(nèi)插試劑溴化乙錠(EB)，可以檢測到幾個皮克的雙鏈DNAEB復(fù)合物，而在瓊脂糖凝膠上用EB染色不能分辨。因此，cE極大地提高了DNA的檢測靈敏度，使檢測所需樣品量劇減，為對DNA微芯片進(jìn)行在板電泳提供了可能。由上，CE又發(fā)展出對于DNA片段的分離以及基因突變的檢測，此外，在毒品、血清蛋白和血色素變異的分析中，CE已成為了常規(guī)的診斷手段。這使它的適用范圍從科研院校擴展到醫(yī)藥衛(wèi)生和國家安全系統(tǒng)，再延伸到體育界的興奮劑檢測等領(lǐng)域。在檢驗檢疫領(lǐng)域，CE靈敏、快速的優(yōu)勢使它成為飲用水、食品、生物醫(yī)學(xué)中病原診斷的最佳工參考文獻(xiàn)1 王茜,丁曉靜,王心宇,等.毛細(xì)管電泳法快速測定保健食品中免疫球蛋白GJ.分析化學(xué),2006,34(7):1161-1164.2 高文惠,裴紅,楊桂君.毛細(xì)管電泳在食品添加劑檢測中的應(yīng)J.食品與生物技術(shù)學(xué)報,2010,29(3): 326-330.3 楊曉云，王立世，莫金垣，等.毛細(xì)管電泳安培法檢測酚類化合物J.分析試驗室.2001,20（3）:6972.4 王義明,羅國安,魏偉,關(guān)燕華.毛細(xì)管電泳的原理及應(yīng)用(第五講)毛細(xì)管電泳在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用.色譜.1997