對化學性肝損傷有輔助保護功能的保健品演示課件

1、1,對化學性肝損傷有輔助保護作用的保健品,2,化學性肝損傷的定義及毒性物質(zhì)分類,化學毒物損傷肝臟的機理,具有保肝作用的功能食品,對化學性肝損傷有輔助保護 作用檢驗方法,3,化學性肝損傷的定義及毒性物質(zhì)分類,定義：是由化學性肝毒性物質(zhì)所造成的肝損傷。 分類：根據(jù)毒性的強弱, 這些親肝毒物可分為三類： 1. 劇毒類：包括磷、三硝基甲苯、四氯化碳、氯奈、丙烯醛等。 2.高毒類：砷、汞、銻、苯胺、氯仿、呻化氫、二甲基甲酰胺等。 3.低毒類：二硝基酚、乙醛、有機磷、丙烯晴、鉛等。,4,化學毒物損傷肝臟的機理,1.脂肪變性。四氯化碳、黃磷等可干擾脂蛋白的合成與轉(zhuǎn)運，形成脂肪肝。 2.脂質(zhì)過氧化反應，這是中

2、毒性肝損傷的特殊表現(xiàn)形式，如四氯化碳在體內(nèi)代謝產(chǎn)生一種氧化能力很強的中間產(chǎn)物，導致生物膜上的脂質(zhì)過氧化，破壞膜的磷脂，改變細胞的結(jié)構(gòu)與功能。 3.膽汁郁積反應，主要與肝細胞膜和微絨毛受損，引起膽汁酸排泄障礙有關(guān)。,5,6,7,具有保肝作用的功能食品,目前我國已經(jīng)研制開發(fā)的, 經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的對化學性肝損傷有保護作用的保健食品共有322種, 最新批準的對化學性肝損傷有保護作用的保健品是北京世紀合輝醫(yī)藥科技有限公司開發(fā)的合輝牌和泰粉。主要原料葛根提取物、黨參提取物、枳椇子提取物、紅景天提取物、葡萄糖。 標志性成分是葛根素。批準日期 是2012年9月18 日，批準文號是國食健字G201

3、20362 。,8,我國具有保肝作用的功能食品的分類,根據(jù)主要功效成分和保健作用, 大致分為以下四類。 1.由中草藥或其提取物研制而成。 如靈芝、大豆、枸杞、茶、黃芪、蘆筍、當歸、山楂、銀杏、香菇等。這類植物具有活血化瘀的、清肝解毒、強肝益肝的作用, 從有效成分來看, 這些保健食品中含有多糖、黃酮類、甙類及萜類化合物,如大豆皂甙、銀杏黃酮類、香菇多糖、黃芪多糖等, 具有提高免疫能力、抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、抗衰老等生物功能。,9,2.目前公認的具有抗氧化、促進細胞增 殖、提高免疫能力的營養(yǎng)物質(zhì) 如?；撬帷⑽?、維生素E、維生素C 等; 維生素E 和硒都是自由基清除劑,大劑量Vc能減輕細胞脂肪性病變

4、, 促進肝細胞再生及肝糖元的合成, 增強肝臟的解毒功能。因此, 對肝炎或肝性昏迷者, 大劑量V c確有治療作用。,10,3.由一些特殊動物如牡蠣、毛蟲甘苦參、甲魚、螞蟻等研制而成。 4.一些特殊生物因子如胎盤因子、多肽等。 谷胱甘肽( GSH) 能與進入體內(nèi)的有毒化合物、重金屬離子或致癌物質(zhì)等相結(jié)合, 并促其排出體外, 起到中和解毒的作用。GSH 還可抑制乙醇侵害肝臟產(chǎn)生脂肪肝。,11,12,13,14,酒前酒后舒肝片 【功效成份及含量】: 粗多糖 190mg ，梔子甙 461.54mg 【主要原料】枸杞子、梔子、茯苓、丹參 【適宜人群】有化學性肝損傷危險者 【不適宜人群】少年兒童 【衛(wèi)生許可

5、證】GD.FDA健證字2006第5100S0267號,15,【品名】同仁堂牌警醒片 【主要原料】L-谷氨酰胺、牛磺酸、維生素C、;-肉堿酒石酸鹽、葡萄糖酸鋅、碳酸鎂、維生素B1、葡萄糖、硬脂酸鎂 【標志性成分及含量】每100g含：牛磺酸20.1g、維生素C6.86g、L-肉堿4.58g 【保健功能】對化學性肝損傷有輔助保護作用 【適宜人群】有化學性肝損傷危險者,16,產(chǎn)品成分 牛磺酸-保護肝細胞、降低血清轉(zhuǎn)氨酶； L-谷氨酰胺-減少和對抗自由基對肝臟的損害； L-肉堿酒石酸鹽(BT)-補充酒精影響肝臟后合成不足，并修復損傷肝細胞； 維生素B1-預防酒精性腦?。?碳酸鎂-能改善酒精引起的精神障礙

6、； 維生素-C抗氧化、參與肉堿生物合成保護肝細胞； 葡萄糖酸鋅-拮抗肝細胞凋亡； 葡萄糖-加快體內(nèi)酒精的分解速度，避免造成酒精中毒。,17,對化學性肝損傷有輔助保護功能食品評價試驗項目、試驗原則及結(jié)果判定,1.試驗項目 動物實驗分為方案一（四氯化碳肝損傷模型）和方案二（酒精肝損傷模型）兩種。 方案一（四氯化碳肝損傷模型） 體重 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT） 谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST） 肝組織病理學檢查,18,方案二（酒精肝損傷模型） 體重 丙二醛（MDA） 還原型谷胱甘肽（GSH） 甘油三酯（TG） 肝組織病理學檢查,19,2.試驗原則 （1）所列指標均為必做項目。 （2）根據(jù)受試樣品作用原理的不同，方案一

7、和方案二任選其一進行動物實驗。,20,3.結(jié)果判定 方案一（四氯化碳肝損傷模型）:病理結(jié)果陽性，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶二指標中任一項指標陽性，可判定該受試樣品具有對化學性肝損傷有輔助保護功能作用。 方案二（酒精肝損傷模型）:肝臟MDA、GSH、TG三項指標結(jié)果陽性，可判定該受試樣品對乙醇引起的肝損傷有輔助保護功能， 肝臟MDA、GSH、TG三指標中任二項指標陽性，且肝臟病理結(jié)果陽性，可判定該受試樣品具有對乙醇引起的肝損傷有輔助保護功能作用。,21,對化學性肝損傷有輔助保護作用檢驗方法,方案一：四氯化碳肝損傷模型 1.原理 四氯化碳(CCl4)受到肝微粒體酶活化成為三氯甲烷自由基(CCl3)與蛋

8、白質(zhì)共價結(jié)合導致蛋白合成障礙、脂質(zhì)分解代謝紊亂，引起肝細胞內(nèi)甘油三酯(TG)蓄積。CCl3也能迅速與O2結(jié)合轉(zhuǎn)化為過氧化三氯甲烷自由基(CCl3O2)導致脂質(zhì)過氧化，從而引起細胞膜的變性損傷,致使酶滲漏以及各種類型的細胞病變，甚至壞死。,22,2.實驗動物 成年大鼠或小鼠，單一性別，大鼠（180220克），每組8-12只，小鼠（1822克），每組10-15只。 3.實驗方法和步驟 3.1 劑量分組及受試樣品給予時間 實驗設(shè)三個劑量組和一個空白對照組和一個模型對照組，以人體推薦量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組。用CCl4（分析純）造成肝損傷模型，造模方式可以灌胃

9、或腹腔注射。小鼠CCl4灌胃濃度為1，以食用植物油稀釋，灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為80 mg/kgBW)，大鼠CCl4灌胃濃度為23%，灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為160240 mg/kgBW)。,23,灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為80 mg/kgBW)，大鼠CCl4灌胃濃度為23%，灌胃量5mL/kgBW(折合CCl4的劑量為160240 mg/kgBW).必要時設(shè)陽性對照組和溶劑對照組。受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天. 3.2 給予受試樣品的途徑 經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無法灌胃時將受試樣品摻入飼料或飲水亦可，并記錄每只動物的飼

10、料攝入量或飲水量。,24,3.3實驗步驟 每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，空白對照組和模型對照組給予蒸餾水。將動物每周稱重兩次，以調(diào)整受試樣品劑量。于實驗第30天將各組動物隔夜禁食16小時，模型組及各樣品組一次灌胃給予CCl4，空白對照組給植物油，受試組繼續(xù)給予受試樣品至實驗結(jié)束（與CCl4灌胃間隔4小時以上）。給予CCl4 后，根據(jù)實際情況于 24或48小時處死動物，取血分離血清，測定ALT、AST，并取肝臟進行病理組織學檢測。,25,3.4 檢測指標 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），肝臟病理組織檢查 4. 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）,谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的測定 4.1 測定方法 可

11、選用全自動生化分析儀或賴氏法（試劑盒）測定。,26,4.2 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。 受試樣品組的ALT、AST與模型對照組比較，差異有顯著性，可分別判定ALT、AST結(jié)果陽性。,27,5. 肝臟病理組織學變化、診斷標準和結(jié)果判定 5.1 實驗材

12、料 取大鼠肝臟左葉用10%福爾馬林固定，從肝左葉中部做橫切面取材，常規(guī)病理制片（石蠟包埋，H.E染色）。 5.2 鏡檢 從肝臟的一端視野開始記錄細胞的病理變化，用40倍物鏡連續(xù)觀察整個組織切片?？梢娦∪~中心性肝細胞的退行性病變和少數(shù)細胞壞死。主要病變類型有肝細胞氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝聚、肝細胞水樣變性和細胞壞死等。,28,5.3 評分標準： 分別記錄每個視野中的各種病變所占視野的面積，并累計所觀察視野的病變總分。 肝細胞氣球樣變,（細胞腫大,胞漿殘留少許）,29,肝細胞脂肪變性：（肝細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)界限清晰脂滴空泡）,30,胞漿凝聚：（胞漿嗜伊紅增強）,31,水樣變性：,32,肝細胞壞死：（

13、胞漿嗜伊紅變，凝固性壞死）,33,5.4 數(shù)據(jù)處理和病理結(jié)果判定 采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。,34,（1）受試樣品任何一個劑量組與模型對照組之間，氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝聚、水樣變性或肝細胞壞死等肝細胞病變中，肝細胞壞死程度減輕，差異有顯著性，而其它病變類型與模型對

14、照組比較明顯減輕或無明顯差異，可判斷動物實驗病理結(jié)果陽性。 （2）受試樣品任何一個劑量組與模型對照組之間，氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝聚、水樣變性這四種肝細胞病變類型加重和減輕同時存在，差異有顯著性，且肝細胞壞死程度減輕，差異有顯著性，則可將其各種病理變化的得分相加，肝細胞壞死評分2倍計入，以總分進行統(tǒng)計分析，若差異有顯著性，可判斷動物實驗病理結(jié)果陽性。,35,6 結(jié)果判斷 在模型成立的前提下，ALT、AST兩項血液生化指標果為中任何一項和病理結(jié)陽性，可判定受試樣品對化學性肝損傷有輔助保護作用。 方案二：酒精肝損傷模型 1.原理 機體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化，使三羧循環(huán)障

15、礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝，致使脂肪在肝細胞內(nèi)沉積。同時乙醇能激活氧分子，產(chǎn)生氧自由基導致肝細胞膜的脂質(zhì)過氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭。,36,2. 實驗動物 成年小鼠或大鼠，單一性別，大鼠（180220克），每組8-12只，小鼠（1822克），每組10-15只。 3. 實驗方法和步驟 3.1 劑量分組及受試樣品給予時間 實驗設(shè)三個劑量組和一個空白對照組和一個模型對照組，以人體推薦量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組。,37,用無水乙醇（分析純）造成肝損傷模型，無水乙醇濃度為50（以蒸餾水稀釋），小鼠灌胃量1214mL/kgBW (折合

16、乙醇的劑量為60007000 mg/kgBW)。受試樣品給予時間30天，必要時可延長至45天。 3.2 給予受試樣品的途徑 經(jīng)口灌胃給予受試樣品，無法灌胃時將受試樣品摻入飼料或飲水亦可，并記錄每只動物的飼料攝入量或飲水量。 3.3 檢測指標 肝組織中丙二醛（MDA） 還原型谷胱甘肽（GSH） 甘油三酯（TG）的含量。,38,3.4 實驗步驟 每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品，空白對照組和模型對照組給予蒸餾水。將動物每周稱重兩次，以調(diào)整受試樣品劑量。給予受試樣品結(jié)束時將模型對照組及各樣品組一次灌胃給予50%乙醇12mL/kgBW，空白對照組給蒸餾水，禁食16小時處死動物，進行各項指標的檢測及病理組織學檢

17、查。,39,4 肝勻漿中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）測 定方法 4.1 原理 MDA (malondiadehycle) 是細胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，檢測其含量可間接估計脂質(zhì)過氧化的程度。MDA與硫代巴比妥酸在酸性條件下共熱，形成粉紅色復合物，吸收峰在535nm,具此可測得MDA的含量 4.2 儀器與試劑 儀器 721分光光度計、微量加樣器、恒溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器,40,試劑 0.2M乙酸鹽緩沖液 PH3.5 0.2M乙酸溶液 185mL 0.2M乙酸鈉溶 15mL 1mmol/L四乙氧基丙烷（貯備液，4保存3個月），臨用前用水稀釋成40nmol/mL

18、 8.1%十二烷基硫酸鈉SDS 0.8%硫代巴比妥酸TBA 0.2M磷酸鹽緩沖液 PH7.4 0.2M磷酸氫二鈉 1920mL 0.2M 磷酸二氫鉀 480mL,41,4.3 實驗步驟 4.3.1 樣品制備 組織勻漿樣品：取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加入0.2M磷酸鹽緩沖液，以20000r/min勻漿10s，間歇30s，反復進行3次，制成5組織勻漿（W/V），3000r/min離心510min，取上清液待測。 4.3.2樣品測定(見下一頁表),42,43,4.3.3計算 過氧化脂質(zhì)含量（nmol/mg組織）= 過氧化脂質(zhì)含量(nmol/100mg蛋白質(zhì))=

19、A: 空白管吸光度 B：樣品熒吸光度 F：四乙氧基丙烷吸光度 C：四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL) K：稀釋倍數(shù),44,4.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。 結(jié)果判定 在模型成立的前提下，受試樣品組的MDA含量與模型對照組比較，差異有顯

20、著性，判定該指標結(jié)果陽性。,45,5 肝勻漿還原型谷胱甘肽（GSH）測定方法 5.1 原理 GSH和5,5-二硫?qū)ο趸姿幔―TNB）反應在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基甲酸陰離子，于423nm波長有最大吸收峰，測定該離子濃度，即可計算GSH的含量。 5.2 試劑 5.2.1 0.9生理鹽水 5.2.2 4磺基水楊酸溶液 5.2.3 0.1mol/L PBS溶液(pH=8.0)： Na2HPO4 13.452g KH2PO4 0.722g 加蒸餾水至1000mL。,46,5.2.4 0.004DTNB溶液： 稱取DTNB 40mg溶于1000mL的0.1mol/L PBS溶液(

21、pH=8.0)中。 5.2.5 疊氮納緩沖液 NaN3 16.25 mg EDTA-Na2 7.44 mg Na2HPO4 1.732 g NaH2PO4 1.076 g 加蒸餾水至1000mL，用少量HCl、NaOH調(diào)pH7.0，4保存。,47,5.2.6 標準溶液： 稱取還原型GSH 15.4mg，加疊氮納緩沖液至50mL，終濃度為 1mmol/L，臨用前配制。 5.3 方法 5.3.1 樣品測定： 取肝臟0.5g加生理鹽水5mL充分研磨成細漿（10%肝勻漿），混勻后取漿液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻，室溫下3000rpm離心10分鐘，取上清液即為樣品。樣品測定管中加4.5mL

22、DTNB，空白管加0.5mL4%磺基水和4.5mLDTNB混勻，室溫放置10 分鐘后，412nm處測定吸光度。,48,5.3.2 標準曲線,49,5.3.3 計算 樣品GSH含量 (mol /g肝重) = 對應曲線濃度值 (mol/L) 50g/L 5.4 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正

23、態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。 結(jié)果判定 在模型成立的前提下，受試樣品組的還原型GSH含量與模型對照組比較，差異有顯著性，判定該指標結(jié)果陽性。,50,2.6 肝勻漿中甘油三酯（TG）測定方法 2.6.1 測定方法：采用甘油三酯測定試劑盒（甘油磷酸氧化酶過氧化物酶法）測定10%肝勻漿中的甘油三酯含量。與血清甘油三酯測定方法相同，以等量10%肝勻漿替代血清按操作說明書進行操作，測定結(jié)果以mmol/g肝重表示。 2.6.2 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 數(shù)據(jù)采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值 F0.05,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值F0.05,P0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。,51,在模型成立的前提下，受試樣品組的TG與模型對照組比較，差異有顯著性，判定該指標結(jié)果陽性。 7 肝臟病理組織學變化、診斷標準和結(jié)果判定 7.1 實驗材料：從肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片，蘇丹染色，。 7.2 鏡檢：從肝臟的一端視野開始記錄細胞的病理變化，用40倍物鏡連續(xù)觀察整個組織切片。主要觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積。,52,7.3 評分標準,53,7.4