臨床免疫學(xué)：第十三章 生物素－鏈霉親和素標(biāo)記免疫技術(shù)

1、1,第十三章 生物素鏈霉親和素標(biāo)記免疫技術(shù) Biotin-Avidin Labelling Immunoassay Tech,2,第一節(jié) 生物素和親和素 第二節(jié) 生物素和親和素標(biāo)記物的制備 第三節(jié) 生物素和親和素系統(tǒng)的技術(shù)方法 第四節(jié) 技術(shù)評價與應(yīng)用領(lǐng)域,3,第一節(jié) 生物素和親和素,生物素（biotin，B）,又稱維生素H 、B7,動植物中廣泛存在，卵黃和肝中含量高； MW244.31D,有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)； 環(huán)為咪唑酮環(huán)，為與親和素結(jié)合部位； 環(huán)為噻吩環(huán)，含一個戊酸側(cè)鏈，其末端可與生物大分子連接，形成生物素標(biāo)記物,T lymphocyte,咪唑酮環(huán),噻吩環(huán),羧基,活化生物素 噻吩環(huán)上戊酸側(cè)鏈的羧

2、基經(jīng)活化修飾后形成的衍生物，只有活化生物素才能偶聯(lián)各種其他生物大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、熒光素等,4,生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)的特點,生物素需活化后才能通過側(cè)鏈與蛋白質(zhì)分子連接； 多價性-一個蛋白質(zhì)分子可以被多個生物素標(biāo)記(放大效應(yīng))； 抗原、抗體標(biāo)記后需保持活性不變； 多用BNHS標(biāo)記抗體和中性或偏堿性的蛋 白質(zhì)，BHZ標(biāo)記偏酸性蛋白（抗原） 可影響標(biāo)記物活性，如堿性磷酸酶標(biāo)記后活性會降低,5,親和素（avidin,A） 從蛋清中提取的一種堿性糖蛋白，耐熱及多種蛋白水解酶作用，每個分子由4條相同亞基組成，每個亞基都可以結(jié)合一個生物素分子。 與生物素結(jié)合的特異性高、穩(wěn)定性好。K=1015L/mol（BA

3、），K=10511L/mol（antigen-antibody） 但與聚苯乙烯的非特異性吸附較高,6,親和素活性單位 以親和素結(jié)合生物素的量來表示； 結(jié)合1g生物素所需要的親合素量為1個親合素活性單位。一般1mg親合素約含1315個活性單位,7,鏈霉親合素（streptavidin,SA） 與親合素(A)有類似生物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)。由Streptomyces avidinii菌分泌的一種蛋白質(zhì)，SA分子量為65000，由4條序列相同的肽鏈構(gòu)成，每條SA肽鏈可以結(jié)合1個生物素分子。 SA與A的ka雖然相同，但在實際應(yīng)用中其檢測靈敏度明顯優(yōu)于A,8,A的高pI及高含糖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致在聚苯乙烯板和硝酸纖

4、維素膜上或與組織細胞DNA結(jié)合時，易產(chǎn)生一定程度的非特異性結(jié)合，造成較高的顯色背景，而SA較A在應(yīng)用中明顯克服了這一缺點,9,親和素和鏈霉親合素理化特性比較,10,第二節(jié) 生物素和親和素 標(biāo)記物的制備,一、生物素標(biāo)記物的制備 1、作為標(biāo)記物，活化生物素直接標(biāo)記大分子生物活性物質(zhì)如抗原、抗體； 根據(jù)抗原或抗體分子所帶可標(biāo)記基團的類型（氨基、醛基或巰 基）以及分子的等電點 2、與其他標(biāo)記物（如酶、熒光素、膠體金）結(jié)合制成新的標(biāo)記物,3、生物素標(biāo)記抗體（IgG）的制備 基本原理 生物素N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）分子酯鍵中的-C=O基團可與蛋白質(zhì)分子中的氨基在堿性條件下形成肽鍵，從而使其標(biāo)記上生

5、物素,11,4、實驗流程 1、用二甲基甲酰胺（DMF）將BNHS配成1mg/ml溶液； 2、用0.1mg/L,pH9.0 NaHCO3溶液將純化的1g抗體稀釋為12g/L; 3、按BNHS：抗體1：8 1：15（體積比）混合，室溫攪拌下反應(yīng)2 4小時； 4、裝入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 透析過夜； 5、結(jié)合物內(nèi)加等體積甘油，小量分裝，-20凍存?zhèn)溆?12,二、親和素標(biāo)記物的制備 1、幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可與親和素結(jié)合，小分子如I125、膠體金、熒光素；大分子如蛋白酶、抗原/體、熒光蛋白等 直接標(biāo)記法：A+E 改良過碘酸鈉法、戊二醛法 間接標(biāo)記法：A+B+E,2、

6、直接標(biāo)記法（HRP-A/SA） a.改良過碘酸鈉法,b.戊二醛法 戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和親和素上的氨基共價結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物,15,戊二醛分子式,3、間接標(biāo)記法（A/SA-B-HRP） 首先將HRP標(biāo)記上生物素 再利用親和素與生物素間的特異結(jié)合能力，合成親和素-生物素-HRP復(fù)合物（ABC,16,注意事項：如何除去未標(biāo)記物？ 各種成份的比例,17,第三節(jié) 生物素和親和素 系統(tǒng)的技術(shù)方法,特異性高、親和力高、穩(wěn)定性好、多級放大作用； 以BAS-酶免疫技術(shù)為例 一、橋聯(lián)親和素生物素法（bridged avidin-biotin technology,BAB

7、法） 直接法：生物素標(biāo)記在一抗上； 間接法：生物素標(biāo)記在二抗上,T lymphocyte,BAB法(直接法)檢測原理示意圖,18,二、標(biāo)記親和素生物素法（labelled avidin-biotin tech, LAB） 直接法 間接法,LAB法(直接法)檢測原理示意圖,20,ABC-雙抗體夾心ELISA檢測原理示意圖,三、親和素生物素化酶復(fù)合物法（ABC,PAP-ABC復(fù)合法檢測原理示意圖,四、酶抗酶親和素生物素化酶復(fù)合物法（PAP-ABC,23,第四節(jié) 技術(shù)評價與應(yīng)用領(lǐng)域,一、技術(shù)評價 1、生物素（B）和親和素（A）之間的高親和力，使反應(yīng)試劑經(jīng)得起高度稀釋，降低或避免了非特異性結(jié)合； 2、

8、二者均可偶聯(lián)蛋白質(zhì)、核酸、多糖等活性物質(zhì)； 3、具有多級放大作用，使其具有高靈敏性,二、應(yīng)用領(lǐng)域 1、BAS與免疫標(biāo)記技術(shù) 適用于微量抗原、抗體及其他生物活性物質(zhì)的定性和定量檢測,2、BAS與親和層析技術(shù)用于蛋白質(zhì)純化，為已知配體尋找受體 基質(zhì)顆粒-親和素 （固相） 生物素化抗體/配體（液相） 待分離物質(zhì)（液相，含目的抗原/配體,25,3、BAS與親和組織化學(xué)技術(shù),4、BAS與基因雜交 5、BAS與放射免疫顯像 6、BAS與免疫-PCR,27,28,1、生物素與親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用，親和常數(shù)（Ka）為1015L/mol，比抗原與抗體間的親和力（Ka=10511L/mol）至少高1萬倍； 2、二者結(jié)合的穩(wěn)定性好，專一性強，不受試劑濃度，pH環(huán)境，抑或蛋白變性劑等有機溶劑影響； 3、由于一個親和素分子可以結(jié)合4個生物素分子，因此BAS具有級聯(lián)放大效應(yīng)，適用于微量成分的檢測； 4. BAS-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素(B)與親和素(A)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng),小結(jié),5、BAS用于檢測的基本方法可分為三大類。 第一類是以親和素兩端分別連接生物素化大分子反應(yīng)體系和標(biāo)記生物素，稱為橋聯(lián)親和素