臨床微生物：第八章腸桿菌科

1、第八章 腸桿菌科 （Enterobacteriaceae）,1,第一節(jié) 概述,1.腸桿菌科細菌共性 2.腸桿菌科細菌鑒定原則 3.腸桿菌科臨床意義,2,掌握,熟悉,1.腸桿菌科細菌的分類,一、分類,抗原分析,生化反應(yīng),核酸雜交,序列分析,33個菌屬 120多個菌種,自然界分布廣泛、種類眾多 大多數(shù)為腸道正常菌群 易培養(yǎng)、繁殖快,臨床常見的有15個菌屬,埃希菌屬 志賀菌屬 沙門菌屬 耶爾森菌屬 克雷伯菌屬 枸櫞酸桿菌屬 腸桿菌屬 沙雷菌屬 變形桿菌屬 泛菌屬 普羅威登菌屬 摩根菌屬 哈夫尼亞菌屬 鄰單胞菌屬 愛德華菌屬,少數(shù)為致病菌，部分為條件致病菌 約40種以上可以在臨床標本中檢出,5,常居菌

2、,埃希菌屬 變形桿菌屬 腸桿菌屬 枸櫞酸桿菌屬 克雷伯菌屬 普羅威登菌屬 摩根菌屬、泛菌屬 沙雷菌屬等,條件致病菌 (一般不致病),致病菌,沙門氏菌屬 志賀氏菌屬 某些埃希菌 耶爾森菌屬（腸內(nèi)和腸外感染）,6,腸桿菌科中與臨床有關(guān)的常見菌屬,埃希菌屬 大腸桿菌 沙門菌屬 傷寒沙門菌 志賀菌屬 痢疾志賀菌 枸櫞酸菌屬 弗勞地枸櫞酸菌 克雷伯菌屬 肺炎克雷伯菌 腸桿菌屬 產(chǎn)氣腸桿菌 泛菌屬 成團泛菌 哈夫尼菌屬 蜂房哈夫尼菌 沙雷菌屬 粘質(zhì)沙雷菌 變形桿菌屬 奇異變形桿菌 摩根菌屬 摩氏摩根菌 普羅威登斯菌屬 斯氏普羅威登斯菌 耶爾森菌屬 鼠疫耶爾森菌,菌屬（genus） 代表種（species）

3、,二、臨床意義,1.菌毛或菌毛樣結(jié)構(gòu) 2.莢膜或微莢膜 3.內(nèi)毒素 4.外毒素（腸毒素）,7,致病物質(zhì),1.腸道內(nèi)感染 急、慢性腸道感染、腹瀉、食物中毒等 2.腸道外感染 鼠疫（烈性傳染?。谀虻?、呼吸道、傷口和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，菌血癥,8,二、臨床意義,所致疾病,9,腸桿菌科細菌引起不同部位感染,中樞神經(jīng)系統(tǒng)（埃希菌屬）,血液（埃希菌屬 、克雷伯菌屬、腸桿菌屬）,胃腸道（某些埃希菌 、沙門菌屬、志賀菌屬、耶爾森菌屬）,泌尿道（埃希菌屬 、變形桿菌屬、克雷伯菌屬、摩根菌屬）,下呼吸道（克雷伯菌屬、腸桿菌屬、埃希菌屬 ）,三、生物學(xué)特性,1.形態(tài)染色結(jié)構(gòu) 革蘭陰性桿菌或球桿狀 多數(shù)有鞭毛 多數(shù)

4、有菌毛 無芽孢,10,鞭毛,共同特性,11,變形桿菌,陰溝桿腸菌,小腸耶爾森菌,傷寒沙門菌,福氏志賀菌,大腸埃希菌,生物學(xué)性狀近似的一大群革蘭陰性桿菌,2.生長條件 需氧或兼性厭氧 營養(yǎng)要求不高 （中等大小、灰白或淡黃色、濕潤、光滑菌落）,12,變形桿菌菌落特征（Mac）,傷寒沙門菌菌落特征 （血平板）,大腸埃希菌菌落特征 （普通平板）,三、生物學(xué)特性,共同特性,3. 生化反應(yīng) 發(fā)酵葡萄糖 氧化酶陰性 觸酶陽性 硝酸鹽還原陽性,13,葡萄糖發(fā)酵（）,觸酶試驗（）,氧化酶試驗（）,硝酸鹽還原試驗（）,三、生物學(xué)特性,共同特性,14,鞭毛抗原（H）,菌體抗原（O）,K或Vi抗原,三、生物學(xué)特性,抗

5、原結(jié)構(gòu),O抗原和H抗原：是腸桿菌科血清分群和分型的依據(jù) 表面抗原（K、Vi抗原）：可阻斷O抗原與相應(yīng)抗體之間的反應(yīng)，加熱（100，15-30min)處理可消除。,15,抗原結(jié)構(gòu),16,耐低溫，不耐熱（60，30min，殺死） 水中生存期較長，不耐干燥 化學(xué)消毒劑敏感 耐膽鹽和抵抗某些染料的作用（伊紅、美蘭等）,三、生物學(xué)特性,抵抗力,17,溶源性轉(zhuǎn)換,生化反應(yīng)性變異,通過,引起,耐藥性變異,毒力性變異,轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo),接合,三、生物學(xué)特性,變異,18, 腸外標本:采自不同的感染部位如血液、體液、 呼吸道、傷口、尿液及其他各種標本。 腸道標本:疾病早期留取新鮮糞便，挑取粘液 膿血部分進行培養(yǎng)。應(yīng)在2

6、h內(nèi)進行，以利志賀 菌等檢出。如不能及時培養(yǎng)應(yīng)冷藏待檢。,樣本采集,四、微生物學(xué)檢驗,腸桿菌科細菌鑒定步驟,科的鑒定：革蘭陰性桿菌，氧化酶陰性 屬、種的鑒定： 各種生化反應(yīng)特征 血清學(xué)試驗,19,鑒定到屬種,20,1.糞便標本：形態(tài)及染色性多無鑒別意義 2.其他標本：革蘭陰性桿菌,標本直接檢查,21,1.腸道外標本： 1）正常無菌標本（血、腦脊液等）先肉湯增菌后 再轉(zhuǎn)種血平板和Mac平板。 2）痰、分泌物等標本：接種血、巧克力平板和Mac。 2.腸道標本： 1）肛拭：GN肉湯增菌后轉(zhuǎn)種至腸道選擇性培養(yǎng)基 2）糞便：直接接種腸道選擇性培養(yǎng)基。 3）如疑耶爾森菌感染可用耶爾森菌選擇瓊脂(CIN)。

7、,分離培養(yǎng),成分和作用： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：提供氮源和碳源 膽鹽、枸櫞酸鈉、煌綠：可抑制腸道非致病菌和革蘭陽性球菌的生長，而對腸道致病菌抑制作用弱。 乳糖、中性紅（pH6.8-8.0，紅橙黃） ：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨產(chǎn)生堿性物質(zhì)菌落淡黃色；大腸桿菌等腸道非致病菌分解乳糖產(chǎn)酸，菌落呈紅色 鐵離子：與硫化氫生成硫化亞鐵黑色沉淀。,22,SS平板（Salmonella-Shigella）分離腸道病原菌的強選擇培養(yǎng)基,腸道病原菌: 小,無色或淡黃色,半透明或不透明菌落 腸道非致病菌: 大,紅色菌落,23,SS平板（Salmonella-Shigella）分離腸道病原菌的強選擇培養(yǎng)基,24,SS平板

8、（空白）,大腸桿菌,傷寒桿菌,25,腸道病原菌:半透明或不透明,無色或灰白、淡黃色 小菌落 腸道非致病菌:紅色（Mac） 、紫黑色(EMB)、藍色 (中國藍）混濁較大菌落。,成分：與SS類似，但不含鐵離子，抑制劑只含膽鹽，可抑制革蘭陽性菌生長，不抑制腸道細菌生長。,麥康凱（Mac）、 EMB（Eosin Methyl Blue， 伊紅美藍)、中國蘭平板 分離腸道病原菌的弱選擇培養(yǎng)基,26,大腸桿菌在Mac上,志賀菌在Mac上菌落,大腸桿菌在Mac上菌落,27,28,腸桿菌科細菌分離鑒定流程,標本,分離培養(yǎng) Mac或EMB或中國蘭/SS （可疑菌落）,生化鑒定,血清學(xué)鑒定,已知Ab檢測未知Ag

9、(玻片凝集試驗),鏡檢（革蘭染色）,藥敏試驗,涂片染色氧化酶/MIU/KIA,分子生物學(xué)鑒定,抗體檢測,腸桿菌科與其它革蘭陰性桿菌區(qū)別,29,30,腸道桿菌IMViC試驗和苯丙氨酸試驗特性,吲哚 甲基紅 V-P 枸櫞酸鹽 苯丙氨酸 埃希菌屬 + + - - - 沙門菌屬 - + - + - 志賀菌屬 -/+ + - - - 克雷伯菌屬 -/+ - + + - 變形桿菌屬 +/- + -/+ -/+ +,腸道致病菌,腸道非致病菌,多不發(fā)酵乳糖,多發(fā)酵乳糖,乳糖發(fā)酵試驗,（初步鑒別腸道致病菌和腸道非致病菌）,31,常規(guī)生化鑒定: 為實驗室最常用的方法。各菌屬(種)主要生化特性有助于鑒定細菌。 2)

10、 鑒定試劑盒: 選用標準化和商品化的微生物鑒定試劑盒， 以細菌生化特性不同為基礎(chǔ)，與編碼技術(shù)結(jié)合， 可人工、儀器讀取結(jié)果，自動化。,腸桿菌科細菌鑒定,32,3) 血清學(xué)鑒定：腸桿菌科中的某些腹瀉病原菌如埃希菌屬，志賀菌屬，沙門菌屬及耶爾森菌屬等的鑒定除生化反應(yīng)外，尚需用已知的特異性抗血清（多價和單價因子血清）與分純的菌落進行凝集反應(yīng)以分群及定型鑒定后才能作出最終報告。,腸桿菌科細菌鑒定,33,4) 分子生物學(xué)鑒定：PCR等，可鑒定至科、屬、種、血清型和腸毒素基因等。甚至可區(qū)分致病菌株和非致病菌株。,5）噬菌體鑒定試驗,腸桿菌科細菌鑒定,肥達試驗：傷寒的輔助診斷,34,抗體檢測,1.常用方法：K

11、-B紙片擴散法、藥敏板或儀器檢測 2.藥物選擇： 3.特殊耐藥檢測：（超廣譜-內(nèi)酰胺酶或AmpC酶）。,35,抗菌藥物敏感試驗,第二節(jié) 大腸埃希菌 （Escherichia coli）,1.細菌特性（形態(tài)染色、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)） 2.臨床意義（致病物質(zhì)、所致疾?。?3.微生物學(xué)檢驗（檢驗程序、檢驗方法） 1.分類、抗原結(jié)構(gòu) 2.標本采集,36,掌握,熟悉,人類標本中分離的埃希菌屬包括6個種： 大腸埃希菌 是人類和動物腸道中的正常菌群 常引起腸內(nèi)外的感染 是腹瀉和泌尿道感染的主要病原菌 出生后數(shù)小時就進入腸道，并終生伴隨 常作為水源、飲用水、食物糞便污染的指標 是基因工程中的主要工程菌。,37

12、,概述,38,在環(huán)境和食品衛(wèi)生學(xué)上，常被用作糞便污染的檢測指標,不得檢出大腸菌群/100ml飲水 細菌總數(shù) 100CFU/100ml飲水 賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲1個/10L 大腸埃希菌和耐熱大腸菌群1個/10L,衛(wèi)生學(xué)指標,總大腸菌群數(shù),每100ml水中大腸菌群數(shù),我國飲用水的微生物標準：,細菌總數(shù),每100ml樣品中細菌總數(shù),人類標本中分離的埃希菌屬包括6個種： 2. 蟑螂埃希菌偶而檢出并有潛在的致病性。 3. 弗格森埃希菌； 4. 赫爾曼埃希菌； 5. 傷口埃希菌 6. E.albertii,39,概述,1885年德國人艾希自人畜腸腔分離出E.coli 1945年Bary自病兒腹瀉便中大量檢

13、出E.coli 1982年美國發(fā)現(xiàn)有種E.coli引起出血性腸炎（HC）和溶血性尿毒綜合征（HUS） 1987年levine提出EHEC概念，指出SLT毒素是病因 1996年日本9000名兒童暴發(fā)腹瀉，11人死亡，E.coli O157：H7是病因,40,41, 侵襲力：K抗原和菌毛 抗吞噬、黏附,42, 內(nèi)毒素：類脂A 具有發(fā)熱、休克、DIC等病理作用 外毒素： 腸毒素:不耐熱(heat labile toxin,LT)和耐熱腸毒素(heat stable toxin, ST) Vero毒素志賀樣毒素（Shiga like toxin，SLT） 引起腸液大量分泌而導(dǎo)致腹瀉,一、臨床意義,致病

14、因素, 腸道外感染 泌尿系統(tǒng)感染（尿道致病性E.coli, UPEC）黏附作用 新生兒腦膜炎/膿毒癥相關(guān)的E.coli(MNEC)K1（+） 菌血癥 膽囊炎、腹膜炎 燒傷創(chuàng)面感染,43,一、臨床意義,所致疾病, 腸道內(nèi)感染(diarrhaegenic E.coli引起） 輕微腹瀉至霍亂樣嚴重腹瀉 致死性并發(fā)癥如溶血性尿毒綜合征。,44,一、臨床意義,所致疾病,腸產(chǎn)毒型大腸埃希菌enterotoxigenic E.coli, ETEC,45,腸侵襲型大腸埃希菌(enteroinvasive E.coli, EIEC),腸致病型大腸埃希菌(enteropathogenic E.coli, EPEC

15、),腸出血型（產(chǎn)志賀毒素）大腸埃希菌enterohemorrhagic(Shiga toxin-producing) E.coli, EHEC,腸集聚型大腸埃希菌(enteroaggregative E.coli, EAEC),Transmission electron micrograph （O157：H7）,STEC,其他：O26、O104,引起腹瀉的大腸埃希菌,46,引起腸道感染的大腸埃希菌 腸道正常菌群大腸埃希菌,47,在一般平板上表現(xiàn) 生化反應(yīng),均相似,二、生物學(xué)性狀,革蘭陰性直短桿狀， 大小為1.01.5m， 有鞭毛能運動， 引起腸外感染的菌株有 莢膜和周身菌毛。,48,鞭毛fla

16、gellum,菌毛 fimbria,形態(tài)結(jié)構(gòu),二、生物學(xué)性狀,兼性厭氧 營養(yǎng)要求不高 可在普通平板，血平板，SS，Mac， EMB，中國藍生長 生化反應(yīng)活潑 能分解多種糖,49,培養(yǎng)特性與生化反應(yīng),50,大腸埃希菌在普通 平板上的菌落特征,51,葡乳麥甘蔗： ,IMViC ：+ + - -,MIU(動力、吲哚、尿素 ) ：+ + -,52,53,復(fù)合生化試驗,克氏雙糖鐵培養(yǎng)基,分解葡萄糖+乳糖 產(chǎn)酸(乳糖多，產(chǎn)酸多） 上下層均變黃,(Kligler Iron Agar,KIA),組成：無糖培養(yǎng)基+1份葡萄糖+10份乳糖 + 鐵鹽 + 酚紅 營養(yǎng) 底物 底物 底物 指示劑,原理： 只分解葡萄糖

17、產(chǎn)酸（葡萄糖少，產(chǎn)酸量少）,上層酸氧化，紅色 下層缺氧，不氧化，黃色,產(chǎn)生硫化氫 + 鐵鹽 FeS 黑色沉淀,應(yīng)用：檢測腸桿菌科細菌對乳糖、葡萄糖的分解和產(chǎn)H2S能力。,54,乳（）葡（） H2S(-),乳（-）葡（+）H2S(+),乳（+） 葡（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）H2S(-),未接種菌的KIA,55,大腸埃希菌在雙糖鐵（KIA)培養(yǎng)基上 生化反應(yīng) : A A + - (A)-乳糖 (A)-葡萄糖 (+)-分解葡萄糖產(chǎn)氣 (-)-不產(chǎn)H2S,二、生物學(xué)性狀,56,O抗原：多糖復(fù)合物(LPS)，耐熱(100) ，171種，血清學(xué)分型的基礎(chǔ)。,H抗原：不耐熱的蛋白質(zhì)，56種。,K抗原：是多糖莢膜抗原，10

18、3種，60種熱不穩(wěn)定，阻止O凝集。,抗原成分,二、生物學(xué)性狀,大腸桿菌血清型按 O：K：H或O：H 的順序以數(shù)字表示, 分成200多血清型 如 O111：K58：H2， O157:H7,57,抗原成分,58,大腸埃希菌檢驗程序,尿液、膿汁、痰、分泌物 血液、腦脊液、膽汁,分離培養(yǎng)（血平板和MAC）,直接檢查 涂片染色鏡檢,增菌培養(yǎng),最終鑒定 全面生化，血清，補充試驗,初步鑒定 形態(tài)特點、菌落特征 氧化酶、KIA、MIU、IMViC,可疑菌落,藥敏試驗,三、微生物學(xué)檢驗,糞便、肛拭、嘔吐物,在腸道選擇性培養(yǎng)基上：Mac、SS 紅色菌落 革蘭陰性桿菌，氧化酶陰性、硝酸鹽還原（+） KIA:AA+-

19、，MIU:+-，IMVC:+-，ORN(鳥氨酸)：+- 用生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗鑒定到屬和種。P107 表9-6 *尿路感染需計數(shù)中段尿細菌總數(shù)，10萬/mL,59,三、微生物學(xué)檢驗,腸外感染大腸埃希菌的鑒定,1. 標本采集,2. 直接涂片染色檢查（除血液標本外）,3. 分離培養(yǎng)鑒定,60,1.標本：糞便、肛拭、嘔吐物 2.分離培養(yǎng)： 肛拭：接種GN肉湯再轉(zhuǎn)種腸道選擇培養(yǎng)基 糞便、嘔吐物：接種腸道選擇培養(yǎng)基 3.同腸外感染標本鑒定程序一樣將E.coli鑒定到種 4.分別進行5種引起腸內(nèi)感染的E.coli鑒定：p105,表8-6,腸道感染大腸埃希菌的鑒定,三、微生物學(xué)檢驗,61,ETEC的鑒定： 分離培養(yǎng)+生化反應(yīng)+血清分型+腸毒素測定,EPEC的鑒定： 分離培養(yǎng)+生化反應(yīng)+血清分型,EIEC的鑒定：生化類似志賀菌 動力（）、乳糖不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵、賴(-) 采用EIEC O:H血清分型，豚鼠眼結(jié)膜試驗 與志賀菌（三者均陰性）鑒別： 醋酸鈉+、葡萄糖銨利用+、黏質(zhì)酸鹽產(chǎn)酸試驗+,EAggEC的鑒定： 液體培養(yǎng)-凝集試驗