第四章藥物定量分析

1、第四章 藥物定量分析 第一節(jié) 定量分析樣品的前處理方法 常用的處理方法 ：藥物分析中常用的分析方法1.不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法2.經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 一不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法（1）直接測定法。如富馬酸亞鐵( 用于各種原因引起的缺鐵性貧血) 溶于熱稀礦酸，采用鈰量法 ，鄰二氮菲作指示劑 富馬酸亞鐵的含量測定: 取本品約0.3g，精密稱定，加稀硫酸15ml，加熱溶解后，放冷，加新沸過的冷水50ml與鄰二氮菲指示液2滴，立即用硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于16.99mg。（2）經(jīng)水解后測定法1. 直接回流后測定法.

2、例如：三氯叔丁醇的含量測定 CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH = (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl+AgNO3= AgCl + NaNO3 AgNO3+ NH4SCN = AgSCN + NH4NO3 2. 用硫酸水解后測定法. 例如：硬脂酸鎂的含量測定 Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 =MgSO4 + 2C17H35COOH H2SO4+2NaOH =Na2SO4 + 2H2O 取本品約0.1g，精密稱定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L)50ml，煮沸至油滴澄清,繼續(xù)加熱10min，放冷至室溫，加甲基橙指示液1-2滴，用

3、氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于2.016mg的MgO。（3）經(jīng)氧化還原后測定法1. 堿性還原后測定 例如：泛影酸（用于泌尿系造影）的含量測定(曙紅鈉指示劑)2. 酸性還原后測定(硫酸鐵銨指示劑) 例如：碘番酸（口服膽囊造影劑）的含量測定 Zn還原后銀量法3. 利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量（1）含銻藥物例如：葡萄糖酸銻的含量測定 Sb5+ +2KI =Sb3+ + 2K+ + I2 I2 +2Na2S2O3 =2NaI +Na2S4O6 （連四硫酸鈉 ） 2）含鐵藥物 2Fe3+ + 2KI =2Fe2+ + 2K+ + I2

4、 I2 +2Na2S2O3 =2NaI + Na2S4O6二、經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 藥物分析中常用的有機(jī)破壞的方法有 干法破壞 濕法破壞 氧瓶燃燒法 (一)濕法破壞 HNO3-HClO4法； HNO3-H2SO4法 ；H2SO4-硫酸鹽法； HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2；H2SO4-KMnO4(二)干法破壞（加Na2CO3或MgO以助灰化；溫度控制在420） 本法系將有機(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的。將適量樣品置于瓷、鎳、鉑坩堝中，常加無水碳酸鈉或輕質(zhì)氧化鎂等以助灰化，混合均勻后，先小火加熱，使樣品完全炭化，然后放入高溫爐中灼燒，使其灰化完全，即可.(適用于濕法不易破壞

5、完全的有機(jī)物（如含氮雜環(huán)類有機(jī)藥物）以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物) (三)氧燃瓶燃燒法(oxygen flask combustion method)原理：將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉的燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或測定含鹵素有機(jī)藥物或含硫、氮、 硒等其它元素的有機(jī)藥物。1.儀器裝置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬質(zhì)玻璃錐形瓶;2. 稱樣：固體樣, 液體樣;3. 燃燒分解操作法;4. 吸收液的選擇 用于X、S、Se等的鑒別、檢查、含量測定時(shí)多數(shù)是H2O或H2O-NaOH；

6、少數(shù)為H2O-NaOH-H2O2應(yīng)用示例：碘苯酯（脊髓蜘蛛膜下腔造影劑，診斷藥）的測定第二節(jié) 定量分析方法特點(diǎn)一、容量分析法 容量分析法的特點(diǎn)：操作簡單、快速；比較準(zhǔn)確（RSD0.2%）；儀器普通易得。（二）、容量分析法的計(jì)算問題 1. 滴定度(T）：每毫升滴定溶液相當(dāng)于被測物質(zhì)的量(mg/mL)。2. 滴定度的計(jì)算 aA + bB =cC + dD T = MAb/aVB（B指標(biāo)液，A指被測物） 3. 百分含量的計(jì)算：（1）直接滴定法D% = V F T/W 100% F = 實(shí)際標(biāo)定的濃度/規(guī)定的濃度（滴定液濃度校正因子） （2）間接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）D% = （VO VB)

7、F T/W 100%二、光譜分析法 （一）紫外-可見分光光度法（200nm760nm) 1. 特點(diǎn)：靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml10-7g/ml 準(zhǔn)確度高，RSD（%）為2%5% 儀器價(jià)格低廉，操作簡單，易普及，應(yīng)用范圍廣。2.朗伯-比耳定律 A = ECL ,E1%1cm = 10/M5. 測定方法 要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3 0.7 常用方法：對(duì)照品比較法：Cx=(Ax/Ar)Cr; 含量%=CxD/W100 %；吸收系數(shù)法： 含量%= (E1%1cm )x/(E1%1cm )r 100 %；計(jì)算分光光度法：VA的三點(diǎn)校正法（1）供試品中干擾物質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)及稀釋用油）的吸收在31034

8、0nm的波長范圍內(nèi)呈線性，且吸收度隨波長的增大而下降。即在維生素A最大吸收波長附近，干擾物質(zhì)的吸收幾乎呈一直線。（2）物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性，即在供試品溶液的吸收曲線上，各波長處的吸收度是維生素A的吸收與無關(guān)吸收的加和值，吸收曲線也是兩者吸收曲線的疊加。 （二）熒光分光光度法( 在溶液中，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時(shí),其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系,即IF=KC ) 1.特點(diǎn)：靈敏度高，可達(dá)10-10g/ml 10-12g/ml ；在低濃度進(jìn)行測定,防止F與C不成正比及自熄滅作用; 用基準(zhǔn)物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減; 靈敏度高，但干擾因素多;制備熒光衍生物，可提高其靈敏

9、度和選擇性用樣品量少，操作簡單，方法快速，應(yīng)用范圍較廣2. 熒光分析儀有二個(gè)單色光器激發(fā)單色光器與發(fā)射單色光器；且激發(fā)光源、樣品池和檢測器成直角3. 含量測定常用的方法對(duì)照品比較法:Ci = (Ri-Rib)/(Rr-Rrb) Cr ch.P收載地高辛片、利血平片、洋地黃毒苷片三、色譜分析法 方法分類按分離原理分為：吸附；分配；離子交換；排阻色譜按分離方法分為：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC。（一）HPLC法1.對(duì)HPLC儀器一般要求 色譜柱、流動(dòng)相按品種項(xiàng)下要求。 2.系統(tǒng)性試驗(yàn)色譜柱的理論板數(shù)：n = 5.54(tR /Wh/2)2. 分離度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 +

10、 W2); 要大于1.5;拖尾因子：T = W0.05h/2d1 應(yīng)在0.9 1.05 3. 測定方法:內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量, 外標(biāo)法測定供試品中主成分含量(標(biāo)準(zhǔn)曲線法，外標(biāo)一點(diǎn)法) 應(yīng)用示例： RP-HPLC法測定鹽酸黃酮哌酯片含量，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，如頭孢拉??；頭孢羥氨芐；頭孢唑啉鈉用外標(biāo)一點(diǎn)法. （二）GC法1.對(duì)GC儀器一般要求 載氣為氮?dú)?；色譜柱為填充或毛細(xì)管柱2. 系統(tǒng)性試驗(yàn)同上述HPLC法，測定方法亦同應(yīng)用示例：Ch.P(2000)收載的月桂卓酮、維生素E及其片劑、注射劑、甲酚皂溶液等均采用GC法中的內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定含量。四、方法的選擇和應(yīng)用 藥品常用含量的測定

11、方法有容量分析法、光譜法和色譜法，各法具有不同的準(zhǔn)確度、專屬性和靈敏度，應(yīng)根據(jù)樣品中被測組分含量高低及共存組分干擾程度等因素選擇合適的分析方法。原則：主藥量大，附加成份不干擾 - 容量法或重量法測定;主藥可溶于有機(jī)溶劑提取后測定 - 光譜法;主藥量少 - 光譜法或色譜法. 1、化學(xué)原料藥純度較高，限度嚴(yán)格，如果雜質(zhì)可嚴(yán)格控制，選擇方法時(shí)可側(cè)重準(zhǔn)確性。 2、中藥材及其成方制劑成分復(fù)雜，被測組分一般含量較低，共存組分干擾嚴(yán)重，選擇方法時(shí)應(yīng)側(cè)重于方法的專屬性和靈敏度。3、化學(xué)藥物制劑種類較多，選擇分析方法時(shí)應(yīng)根據(jù)制劑中被測組分的含量高低、復(fù)方制劑中共存組分影響以及輔料成分的干擾程度進(jìn)行選擇。（見教材

12、) 4、應(yīng)用實(shí)例。（見教材)第三節(jié) 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證 一、準(zhǔn)確度指用該方法測定結(jié)果與真實(shí)值接近的程度，用回收率(比值）表示(指在實(shí)際樣品中加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品于相同條件下進(jìn)行測量,用所得結(jié)果計(jì)算 .)（一）含量測定方法的準(zhǔn)確度 1.原料藥：可用已知純度對(duì)照品或樣品進(jìn)行測定；或與已建準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。2. 制劑 要考察輔料對(duì)回收率的影響。采用在空白輔料中加入原料對(duì)照品的方法作回收率試驗(yàn)，然后計(jì)算RSD具體做法：測定高、中、低三個(gè)濃度，n=3, 共9個(gè)數(shù)據(jù)來評(píng)價(jià)回收率的RSD2%；用UV和HPLC發(fā)時(shí)，一般回收率可達(dá)98%102%；容量法可達(dá)99.7%100.3%

13、回收率% = （測定平均值 空白值）/加入量100%二、精密度是指在規(guī)定的測試條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次測定結(jié)果之間的接近程度。（一）精密度表示方法1. 偏差(deviation , d) d = 測得值-平均值=Xi-X 2. 標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation, SD或S）S =(Xi X)2/(n-1)1/2 3. 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation, RSD)也稱變異系數(shù)(coefficient of variation, CV) RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值100%=S/X 100% （二）重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性 1. 重復(fù)性在相同條件

14、下,由一個(gè)分析人員測定所得結(jié)果的精密度. 2. 中間精密度 在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果的精密度。 3. 重現(xiàn)性 在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測定結(jié)果的精密度。 三、專屬性是指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。 （一）鑒別反應(yīng)應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。 四、檢測限（limit of detection, LOD) 是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗(yàn)指標(biāo)。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可

15、。 （一）常用的方法 1.非儀器分析目視法用已知濃度被測物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。2.儀器分析方法 UV法：LOD = f.3S空 = C樣/A樣 3S空Flu法：LOD = f.3S空 = C樣/(F樣-F空) 3S空 GC和HPLC法： LOD = S/N = 2或3 （二）數(shù)據(jù)要求 應(yīng)附測試圖，說明測試過程和檢測限結(jié)果。 五、定量限（limit of quantitation, LOQ)是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進(jìn)行定量測定時(shí)，要求LOQ.常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時(shí)相應(yīng)的濃度進(jìn)行測定。六、線性是

16、指在設(shè)定的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。 UV法：首先制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n =5; A = 0.3.0.7建立回歸方程C = aA + b ;r 0.9999。HPLC法：制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n =57; 以C對(duì)h或A或與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，建立回歸方程r0.9999。七、范圍是指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。 原料藥和制劑含量測定：范圍應(yīng)為測試濃度的80%- 120%。 制劑含量均勻度檢查：范圍應(yīng)為測試濃度的70%- 130%。 溶出度或釋放度中的溶出量測定：范圍應(yīng)為限度的20%。八、耐用性是指在測定條件下有效的變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響的