脂肪酸氣相色譜技術(shù)鑒定創(chuàng)傷弧菌

1、脂肪酸氣相色譜技術(shù)鑒定創(chuàng)傷弧菌 王志剛 邵平揚(yáng) 徐幼平 摘要 目的:建立細(xì)菌脂肪酸氣相色譜分析技術(shù)對創(chuàng)傷弧菌(VV)鑒定的新方法。方法:創(chuàng)傷弧菌經(jīng)35C、24 h血平板培養(yǎng)，收集菌落，皂化、甲基化、萃取、洗滌步驟，采用氣相色譜法測定VV細(xì)菌脂肪酸的種類與含量結(jié)果，并與軟件標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對與識別。結(jié)果 20分鐘內(nèi)色譜給出VV脂肪酸特征圖，峰位與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的差異僅為0.21%，99.17%的峰能明確識別，VV的脂肪酸種類與含量為 C16：0 (29.66%) ,C16:17C/C16:16C(28.32%), C18:17C (13.42%), C14:0 (5.41%), C14:0 3OH/C1

2、6:1 iso 1(4.31%) and C12:0 3OH (4.01%)。結(jié)論: 細(xì)菌脂肪酸的種類與數(shù)量可作為細(xì)菌鑒定特征，氣相色譜分析技術(shù)具有靈敏、精確、快速特點(diǎn)，與經(jīng)典的細(xì)菌生化反應(yīng)及DNA鑒定相比，具有生物安全、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，為臨床實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌的鑒定開辟了新途徑。關(guān)鍵詞：創(chuàng)傷弧菌，脂肪酸; 氣相色譜法Identification of Vibrio Vulnificus by fatty acid analysis with Gas Chromatography Zhigang Wang, Pinyang Shao，Youping Xu. Department of clinical

3、 laboratory, The second hospital of Jiaxing, Zhejian province, Jiaxing,341000，chinaAbstract Objective: To establish new method for identification of Vibrio Vulnificus(VV) by fatty acid analysis with gas chromatography(GC). Methods VV strain were cultivated on sheep blood agar 35C for 24 hours. By Ha

4、rvesting, Saponification，methylation，extraction and basic wash steps. The whole cellular fatty acids were detected by gas chromatography. We matched Peak position of sample results with reference chromatograms. Results The rapid analysis extract to identification VV within 20 minutes. Peak position

5、error were 0.21%.Percent named were 99.17%. bacteria extracts contain straight and branched fatty acids with 9 to 20 carbon lengths. Strain VV summed feature contained C16：0(29.66%),C16:17C/C16:16C(28.32%), C18:17C (13.42%), C14:0 (5.41%), C14:0 3OH/C16:1 iso 1(4.31%) and C12:0 3OH (4.01%) as the ma

6、jor fatty acids. Conclusions According to the qualitative and quantitative differences in fatty cell profiles can differentiate species and sub-species, which combines highly sensitivity, accurate, rapid microbial identification, less expensive and more safety than conventional biochemical/ DNA-base

7、d identification. . We presented a novel fatty acid analysis methodology for identification VV. Key words Vibrio Vulnificus（VV）;Fatty acid（FA）; Gas Chromatography（GC）2006年8月，美國Emerging infectious diseases雜志將創(chuàng)傷弧菌（Vibrio Vulnificus，VV）列入最危險(xiǎn)的細(xì)菌之列1，其原因是VV感染者的臨床致死率超過50%，在歐美、日本、香港冠以“flesh eating bacteria”

8、-“食肉菌”稱號2。一般認(rèn)為臨床對VV感染的早期鑒定成為搶救成功的關(guān)鍵，故對VV的快速診斷顯得尤為重要。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分類與鑒定主要依靠細(xì)菌對糖類、蛋白質(zhì)利用的生化反應(yīng)及細(xì)菌核酸分型2種。而脂肪酸(Fatty acid, FA)作為細(xì)胞的基本成份，常以脂化狀態(tài)存在,組分相對穩(wěn)定，不同種屬的細(xì)菌,其脂肪酸的組成和含量表現(xiàn)出不同程度的差異3、4，脂肪酸的種類和數(shù)量與細(xì)菌的特征、遺傳密切相關(guān)，可作為細(xì)菌鑒定的生物標(biāo)記物之一5、6。我們根據(jù)美國FDA推薦的細(xì)菌脂肪酸分析技術(shù)7，將細(xì)菌短鏈脂肪酸（C9C20）的種類和含量的檢測結(jié)果，用于細(xì)菌的分類與鑒定，現(xiàn)將脂肪酸的氣相色譜分析技術(shù)運(yùn)用與創(chuàng)傷弧菌的

9、鑒定實(shí)驗(yàn)介紹如下：基金項(xiàng)目：浙江省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（2009F10011）； 嘉興市第一批科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009AY2047）作者單位：314000 浙江省嘉興市第二醫(yī)院 （王志剛、邵平揚(yáng)） , 浙江大學(xué)分析測試中心（徐幼平）作者簡介：王志剛，主任技師、碩士生導(dǎo)師，嘉興市自然科學(xué)優(yōu)秀論文一等獎、科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎獲得者，現(xiàn)為嘉興市衛(wèi)生系統(tǒng)學(xué)科帶頭人、嘉興市專業(yè)技術(shù)后備學(xué)科帶頭人。Tel: E-mail: X材 料 與 方 法1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)菌株：從我院臨床死亡病例血液中分離得到，經(jīng)VITEK-32型細(xì)菌鑒定儀鑒定，GNI+細(xì)菌鑒定卡、API 20E

10、確認(rèn)。該菌株轉(zhuǎn)種血清半固體，加液體石蠟油封閉，低溫保存?zhèn)溆谩?.2 實(shí)驗(yàn)儀器和分析軟件：美國Agilent HP6890型氣相色譜系統(tǒng)進(jìn)行脂肪酸種類與含量的測定，色譜結(jié)果與美國MIDI公司脂肪酸成份鑒定CLIN40菌種庫軟件數(shù)據(jù)分析比較。1.3 試劑：脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號601230-A)，由美國MIDI公司提供：包括脂肪酸甲酯混合物液，含C9C20直鏈飽和脂肪酸甲酯及2-羥基-10碳、3-羥基-10 碳、2-羥基-14 碳、2-羥基-16碳飽和脂肪酸等。皂化試劑(氫氧化鈉45g、甲醇 150ml、水150ml)；甲基化試劑（6.0N鹽酸 325ml、甲醇275ml）；萃取溶劑（己烷200ml、

11、甲基叔丁醚200ml）；堿性洗滌液（氫氧化鈉10.8g、水900ml）配置備用。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 細(xì)菌的獲?。簩V菌按四區(qū)畫線法接種于無脂肪成份的TSBA平板，35、24h培養(yǎng)。用無菌接種環(huán)取第三區(qū)的菌落40mg，置無菌、干燥有螺旋蓋的試管底部。1.5脂肪酸抽提步驟：1.5.1皂化：在上述試管中加入1.Oml的皂化試劑，蓋緊試管，震蕩試管10s，放入100沸水中水浴，5 min之后從沸水中移出、冷卻，震蕩10s。再將試管放回水浴中，繼續(xù)加熱25 min。沸水中皂化共30min，冷卻。1.5.2甲基化：將脂肪酸轉(zhuǎn)化成甲基脂肪酸，每管加入2.0ml甲基化試劑，栓緊蓋子后震蕩10s，置8

12、0水浴加熱10 min，用冷水快速冷卻至室溫。1.5.3萃?。杭谆舅釓乃噢D(zhuǎn)移到有機(jī)相。每管加入1.25ml萃取溶劑，蓋緊試管蓋子，置28搖床溫和混勻10min，取干凈吸管吸取上層有機(jī)相，放入另一試管。1.5.4洗滌：在試管中加入3.Oml堿洗滌液，栓緊蓋子，震蕩試管5min，靜止數(shù)分鐘，分層清晰。1.5.5將萃取物移至樣品小瓶：用干凈吸管吸取上層有機(jī)相，轉(zhuǎn)移到干凈的色譜樣品小瓶。1.6 氣相色譜分析:美國Agilent HP6890型氣相色譜儀：色譜柱為Agilent 19091B-102型，脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號601230-A）定標(biāo)，定標(biāo)通過后，加待檢細(xì)菌樣本。爐溫40、進(jìn)樣口250、檢

13、測器300；氫氣流量30mL/min、空氣流量400mL/min、氮?dú)饬髁?0mL/min；氫氣壓力10.6psi，檢測器為氫火焰離子檢測器。1.7 結(jié)果分析:獲取氣相色譜圖給出保留時(shí)間、響應(yīng)值、色譜峰等參數(shù)表及色譜圖，經(jīng)SAS軟件統(tǒng)計(jì)，與CLIN40菌種庫數(shù)據(jù)比對。結(jié) 果1.標(biāo)準(zhǔn)短鏈脂肪酸定標(biāo)圖譜結(jié)果顯示，含C9C20飽和直鏈脂肪酸及2-羥基-10碳，3-羥基-10 碳，2-羥基-14 碳，2-羥基-16碳側(cè)鏈脂肪酸甲酯清晰，檢測結(jié)果與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)峰的吻合度為99.92%，峰位匹配誤差為0.21%（見表1、圖1）。表1：脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖的主要參數(shù)表：RTResponseAr/HtRFact

14、ECLPeak NamePercentComment1Comment21.4795.31E+80.019-7.029SOLVENT PEAK- min rt2.411497660.0191.1349.0009:05.382.8831044000.0211.09510.00010:010.91Peak match 0.00023.540533480.0231.06011.00011:05.40Peak match 0.00173.675209830.0251.05511.15410:0 2OH2.11Peak match -0.00523.907111170.0241.04711.42010:0

15、 3OH1.11Peak match 0.00374.4141095210.0261.03012.00012:010.76Peak match -0.00055.518563770.0281.00513.00013:05.40Peak match 0.00126.8411153600.0320.98414.00014:010.82Peak match -0.00048.341586480.0370.96815.00015:0-Peak match -0.00068.669212680.0370.96515.20114:0 2OH1.96Peak match 0.00159.133110510.

16、0360.96215.485Sum In Feature 21.01Peak match 0.002414:0 3OH/16:1 iso I9.9741185110.0380.95716.00016:010.81Peak match -0.001911.677598140.0370.95017.00017:05.42Peak match -0.000712.079208630.0430.95017.23116:0 2OH1.89Peak match 0.001713.4151191600.0400.94918.00018:010.79Peak match -0.001215.149593310

17、.0420.95419.00019:05.40Peak match 0.001316.8671177390.0420.96320.00020:010.82Total Response: 1049453 Total Named: 1048608Percent Named: 99.92% Total Amount: 1105160Profile Comment: Good peak matching. Peak position matching error (RMS) is 0.0021.Matches: Sim IndexEntry Name0.991MIDI Calibration Mix

18、1 圖1.脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖2.VV脂肪酸種類與含量測定：從VV全細(xì)胞C10C20脂肪酸氣相色譜結(jié)果顯示，VV脂肪酸主要峰有6個(gè)（見表2、圖2），其中VV所含脂肪酸類型依次為：十六碳飽和脂肪酸（C16：0），7C-十六碳不飽和脂肪酸（C16:17C）/6C-十六碳不飽和脂肪酸（C16:16C），7C-十八碳不飽和脂肪酸（C18:17C），十四碳飽和脂肪酸（C14:0），3-羥基-十四碳飽和脂肪酸（C14:0 3OH）/異式十六碳不飽和脂肪酸（16:1 iso 1）及3-羥基-十二碳飽和脂肪酸（C12:0 3OH）為主。上述脂肪酸含量分別為29.66%，28.32%，13.42%，5.41%

19、，4.31%及4.01%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CLIN40菌種庫標(biāo)準(zhǔn)VV圖譜的匹配程度達(dá)99.17%，與霍利斯弧菌的相似度為46.7%（見表2、圖2）。表2：VV脂肪酸氣相色譜結(jié)果的參數(shù)表：RTResponseAr/HtRFactECLPeak NamePercentComment1Comment21.4764.634E+80.023-7.030SOLVENT PEAK- min rt2.8792240.0231.08310.00110:00.17ECL deviates 0.001Reference -0.0013.48024420.0261.05310.918Sum In Feature 21.8

20、1ECL deviates 0.00412:0 aldehyde ?4.40523620.0361.02311.99912:01.70ECL deviates -0.001Reference -0.0036.10857550.0310.99313.45412:0 3OH4.01ECL deviates 0.0006.82978150.0320.98513.99914:05.41ECL deviates -0.001Reference -0.0037.7663710.0330.97714.62415:0 iso0.25ECL deviates 0.001Reference -0.0019.123

21、63410.0400.96915.487Sum In Feature 24.31ECL deviates -0.00114:0 3OH/16:1 iso I9.35011330.0370.96815.62616:0 iso0.77ECL deviates -0.001Reference -0.0049.59017150.0350.96715.77316:1 w9c1.16ECL deviates -0.0019.660417290.0370.96615.816Sum In Feature 328.32ECL deviates -0.00616:1 w7c/16:1 w6c9.71954200.

22、0350.96615.852Sum In Feature 33.68ECL deviates 0.00016:1 w6c/16:1 w7c9.8108100.0370.96615.90816:1 w5c0.55ECL deviates -0.0019.960437600.0370.96516.00016:029.66ECL deviates 0.000Reference -0.00311.0335960.0410.96216.63017:0 iso0.40ECL deviates 0.000Reference -0.00311.3065990.0270.96116.79117:1 w8c0.4

23、0ECL deviates -0.00111.66510030.0340.96117.00117:00.68ECL deviates 0.001Reference -0.00212.91013060.0390.95917.717Sum In Feature 50.88ECL deviates -0.00318:2 w6,9c/18:0 ante12.99714390.0410.95917.76718:1 w9c0.97ECL deviates -0.00213.092199430.0410.95917.822Sum In Feature 813.43ECL deviates -0.00118:

24、1 w7c13.40021290.0440.95917.99918:01.43ECL deviates -0.001Reference -0.004ECL Deviation: 0.002 Reference ECL Shift: 0.003 Number Reference Peaks: 9Total Response: 148123 Total Named: 146891Percent Named: 99.17% Total Amount: 144224Matches: Sim IndexEntry Name0.708Vibrio-vulnificus0.467Grimontia-holl

25、isae Vibrio圖2：菌株VV脂肪酸氣相色譜圖討 論細(xì)菌脂類包括：脂肪酸、枝菌酸（mycolic acid）、磷酸類脂（phospolipid）、醌（quinone）等，一般以酯化狀態(tài)存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁及細(xì)胞器中，由于脂肪酸組分在細(xì)菌結(jié)構(gòu)中的種類與含量相對恒定8，脂肪酸組份在不同種屬的細(xì)菌中有很大區(qū)別，故細(xì)菌脂肪酸的組成與含量中蘊(yùn)藏了豐富的分類學(xué)信息值得研究9。1963年,美國Able首次將氣相色譜技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞的脂肪酸成分分析10。目前，臨床細(xì)菌的鑒定主要依靠細(xì)菌生化反應(yīng)及核酸基因分型為基礎(chǔ)，而我們介紹的是根據(jù)細(xì)菌短鏈脂肪酸（C9C20）的種類和含量的差異，進(jìn)行細(xì)菌鑒定的新方法：通過細(xì)

26、菌脂肪酸指紋圖譜識別，作為VV鑒定的生物標(biāo)記物。我們將細(xì)菌在無脂質(zhì)成份的TSBA培養(yǎng)基上所得的VV菌落，通過細(xì)菌脂肪的皂化、甲基化、萃取、洗滌等過程，將細(xì)菌脂肪酸從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相，再采用氣相色譜技術(shù)，測定出VV脂肪酸種類與相對含量，再現(xiàn)VV細(xì)菌脂肪酸指紋圖譜11。利用CLIN40菌種脂肪酸數(shù)據(jù)庫軟件，鑒定出細(xì)菌的菌種。若脂肪酸色譜主峰存在明顯差別，則提示不同的種或?qū)俚募?xì)菌；若脂肪酸色譜主峰相似，僅存在峰高的差別，則提示相同的細(xì)菌種、不同的菌株。細(xì)菌脂肪酸的色譜分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)菌處于殺滅狀態(tài)，具有生物安全方面優(yōu)勢，適用于高危險(xiǎn)的細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室鑒定，如結(jié)核桿菌、炭疽桿菌、豬鏈球菌等

27、；同時(shí)，鑒定時(shí)間短，在得到菌落后，2h內(nèi)能完成菌種鑒定，適宜于重要致病性細(xì)菌的快速診斷，如炭疽桿菌、創(chuàng)傷弧菌等，尤其對生長緩慢細(xì)菌非常適宜，如結(jié)核桿菌；再則，所用的試劑均為普通的酸、堿、氣體、有機(jī)溶劑等，故每一測試成本低；同時(shí)細(xì)菌數(shù)據(jù)庫兼容性強(qiáng)，能鑒定出的細(xì)菌種類多，采用統(tǒng)一規(guī)范的操作步驟，能鑒定出不同屬、種、型的細(xì)菌株。缺點(diǎn)是要強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、菌齡、色譜條件等實(shí)驗(yàn)條件需標(biāo)準(zhǔn)化,盡量在相同條件下操作，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性，否則會影響細(xì)菌鑒定的可重復(fù)性與準(zhǔn)確性12?？傊?，細(xì)菌脂肪酸氣相色譜分析技術(shù)的應(yīng)用，為臨床實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌鑒定開辟了新途徑。參 考 文 獻(xiàn)1.Chung PH, Chuan

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