ELISA IL-6(人白介素) 操作流程

1、；. 人白介素人白介素 6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 使用說明書使用說明書 產(chǎn)品編號：1910231 本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷! 預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用 ELISA 法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中 IL-6 含量。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 用純化的 IL-6 抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生 物素化的 IL-6 抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物(TMB)顯色。TMB 在過氧化 物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 IL-6 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 45

2、0nm 波長下測定吸光度（值） ，計(jì)算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制 1、 酶標(biāo)板：酶標(biāo)板：一塊（96 孔） 2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2 瓶，請臨用前 15 分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至 1ml， 蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為 10,000 pg/ml， 將其稀釋為 500 pg/ml 后，再做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋）（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋） ， 分別配制成 500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，15.6 pg

3、/ml，7.8 pg/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml。如配制 500 pg/ml 標(biāo)準(zhǔn)品： 取 0.5ml （不要少于 0.5ml ）500 pg/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。 3、 樣品稀釋液樣品稀釋液：125ml。 4、 人白介素人白介素 6:6:125ml。 5、 HRP,100XHRP,100X：1150 /瓶（1:100） 。臨用前以 HRPHRP 1:100 稀釋（如：10 HRP / 990 HRP 稀釋液） ，充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制 （100 /孔）

4、，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。 6、 HRP 稀釋劑稀釋劑：112ml。 7、 濃洗滌液濃洗滌液：150ml/瓶。使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋 10 倍。 8、 底物溶液底物溶液：112ml/瓶， 9、 終止液終止液：112ml/瓶（2 mol/L H2SO4） 。 10、覆膜覆膜：4 張 11、使用說明書：使用說明書：1 份 自備物品自備物品 . ；. 1、 酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱） 2、 微量加液器及吸頭，EP 管 3、 蒸餾水或去離子水，濾紙 標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存 1、 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置 2 小時(shí)或 4過夜后于 1000 g 離心 20 分鐘，取上清即

5、可 檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 2、 血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)于 1000 g 離心 15 分鐘， 取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3、 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請 1000 g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨?置于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 注：以上標(biāo)本均應(yīng)注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存，密封保存，4 4保存應(yīng)小于保存應(yīng)小于 1 1 周，周，-20-20不應(yīng)超過不應(yīng)超過 1 1 個(gè)月，個(gè)月，-80-80不應(yīng)超過不應(yīng)超過 2 2 個(gè)月；標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因

6、此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。個(gè)月；標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。 操作步驟操作步驟 實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在室溫溶解；試劑或樣品配制時(shí)， 均需充分混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時(shí)，應(yīng)對樣實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時(shí)，應(yīng)對樣 品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。 1、 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?100 ，余孔分別加 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品 100 ，注意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品

7、加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸 及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，室溫溫育 2 小時(shí)。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效 性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 2、 洗滌：棄掉板孔中的液體，加滿洗滌液，靜止放十秒，洗四次，最后在毛巾或吸水紙上拍 干板子： 3、 每孔加 HRPHRP（臨用前配制）100 ，加上覆膜，室溫溫育 1 小時(shí)。 4、 洗滌：同第二步。 5、 每孔加底物溶液底物溶液 100 ，酶標(biāo)板加上覆膜室溫避光顯色避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在 15-30 分鐘， 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前 3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3-4 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止） 。 6、

8、 每孔加終止溶液終止溶液 100 ，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底 物 液的加入順序相同，立即瀆數(shù)。 7、 立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（值） 。 注注： . ；. 1、 試劑準(zhǔn)備：試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。 實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。 2、 加樣：加樣：加樣或加試劑時(shí)，第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不 同的 “預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括 標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）最好控制在 10 分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3、

9、溫育：溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)； 洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守 給定的溫育時(shí)間和溫度。 4、 洗滌洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中 吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。 5、 反應(yīng)時(shí)間的控制：反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔 10 分鐘） ，如 顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。 6、 底物：底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。 洗板

10、方法洗板方法 1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少 0.4ml 注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘，吸去（不可 觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾 次；根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。 2、 自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。 特異性特異性 本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人 IL-6，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。 計(jì)算計(jì)算 各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點(diǎn)圖） ，如設(shè)置復(fù)孔，則 應(yīng)取其平 均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)） ，值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)） ，在對數(shù)坐 標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù) 樣品值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算 出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，