實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的沉淀與凝固

1、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的沉淀與凝固 蛋白質(zhì)溶液是一穩(wěn)定的親水性溶膠液，其穩(wěn)定的因素有二：一是蛋白質(zhì)膠粒上的電荷使之相互排斥，不易凝集成團(tuán)；二是膠粒表面的水化膜，它使膠粒與水融洽相依，又在膠粒之間起了隔離作用。如果上述兩種穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素被破壞，蛋白質(zhì)將于溶液中沉淀析出。 促使蛋白質(zhì)沉淀的因素很多，大致可分為兩類：第一類是可逆的沉淀反應(yīng)。這時(shí)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象未受到很大改變，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如鹽析和低溫乙醇沉淀蛋白。第二類是不可逆的沉淀反應(yīng)，重金屬鹽類或生物堿試劑沉淀蛋白后，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白質(zhì)沉淀多表示蛋白質(zhì)已經(jīng)變性。變性的蛋白質(zhì)在等電

2、點(diǎn)附近加熱時(shí)，蛋白質(zhì)分子間相互盤(pán)繞而變成堅(jiān)實(shí)的凝塊。一、 蛋白質(zhì)的鹽析 原理高濃度的鹽離子可與蛋白質(zhì)膠粒爭(zhēng)奪水化膜，同時(shí)鹽又是強(qiáng)電解質(zhì)，可抑制蛋白質(zhì)的解離。因而用高濃度的中性鹽，使蛋白質(zhì)帶電量減少，水化膜破壞而從溶液中沉淀出來(lái)。鹽析沉淀蛋白一般不引起蛋白變性，故常用于分離各種天然蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的組成及性質(zhì)不同，所以鹽析時(shí)所需中性鹽的濃度也不相同。例如半飽和的硫酸銨沉出球蛋白，飽和的硫酸銨則沉出清蛋白。 操作 1.取一試管，加入3ml 5%蛋白質(zhì)溶液及3ml飽和硫酸銨溶液，搖勻靜止數(shù)分鐘后觀察現(xiàn)象。 2.將試管內(nèi)容物過(guò)濾，加硫酸銨粉末于濾液中，使達(dá)飽和狀態(tài)，搖勻后觀察現(xiàn)象。（注意固體硫酸銨若

3、加到過(guò)飽和則有結(jié)晶析出，勿與蛋白質(zhì)沉淀混淆。） 3.取上項(xiàng)渾濁液1ml，加水2ml，觀察是否復(fù)容。二. 乙醇沉淀蛋白質(zhì) 原理乙醇是脫水劑，可與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水化膜；此外，加入乙醇可使水的介電常數(shù)變小，蛋白質(zhì)解離度降低，帶電量減少。故加入乙醇能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)沉淀。用此法在低溫下操作可使沉出的蛋白質(zhì)保持其理化特性及其生物學(xué)活性，但室溫中乙醇與蛋白質(zhì)接觸較久后，可使之變性，形成不可逆的沉淀。 操作1. 取試管4支，標(biāo)出1、2、3、4號(hào)碼，按下表操作試劑 12345%蛋白質(zhì)溶液（ml）111-1%乙酸（滴）-1-2-95%乙醇（ml）-2 2.將3管及4管置冰水中，放置5分鐘，然后將第4管

4、的冰乙醇倒入第3管中（此步最好在冰水中進(jìn)行），混勻，同時(shí)向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2ml混勻，觀察各管的沉淀情況并立即向第1、2及3管中各加入蒸餾水10ml，混勻，比較各管變化并解釋之。三. 重金屬鹽沉淀蛋白 原理 在溶液的PH值大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)與重金屬離子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、Pb2+等）結(jié)合成鹽而沉淀。 操作 取試管4支，按下表操作。試劑 （滴）12345%蛋白質(zhì)溶液55551%乙酸 -101010g/L硫酸銅3-3-30g/L硝酸銀-3-3混合均勻，比較各管渾濁程度并解釋之。四. 生物堿試劑沉淀蛋白 原理能沉淀生物堿（或植物堿）或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的

5、物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。在溶液的PH值小于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，帶正電荷的蛋白質(zhì)與生物堿試劑的負(fù)離子結(jié)合成鹽而沉淀。 操作 取試管3支，按下表操作。試 劑 1235%蛋白質(zhì)溶液（ml）1111%乙酸（滴）101010苦味酸溶液（滴）數(shù)滴-鞣酸溶液（滴）-數(shù)滴-三氯乙酸溶液（滴）-數(shù)滴混合均勻，比較各管渾濁程度并解釋之。五. 蛋白質(zhì)的加熱凝固 原理 蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)附近加熱，即發(fā)生變性凝固，在加熱過(guò)程中，隨著蛋白質(zhì)變性作用的深化，使已變性的蛋白質(zhì)分子間凝聚成凝膠狀的蛋白塊。但應(yīng)注意，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液遠(yuǎn)離等電點(diǎn)而帶有很多同種電荷時(shí)，加熱雖可使其變性，但因同種電荷的排斥作用并不發(fā)生凝固

6、現(xiàn)象。 操作取試管4支，按下表操作試 劑12345%蛋白質(zhì)溶液（ml）22221%乙酸（滴）-1-2-10%乙酸（ml）-0.5-100g/LNaOH（ml）-0.5混勻后各管分別加熱，觀察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解釋之。另外在第2管加熱蛋白沉出后再加入5ml蒸餾水，觀察是否復(fù)溶，為什麼？ 試劑 15%蛋白溶液：取出雞蛋清用蒸餾水稀釋5倍，攪勻后用紗布過(guò)濾。 2飽和硫酸銨溶液。 3硫酸銨結(jié)晶粉末。 495%乙醇。 51%乙酸和10%乙酸。 630g/L硝酸銀溶液。 710g/L硫酸銅溶液。 8100g/L氫氧化鈉溶液。 9苦味酸飽和溶液及鞣酸飽和溶液。 10100g/L三氯乙酸溶液

7、。 （李素婷） 實(shí)驗(yàn)三 微量凱氏定氮法 原理蛋白質(zhì)樣品與濃硫酸共熱時(shí)，分解出氮、二氧化碳和水，而氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘?，氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，再與納氏試劑顯色，與標(biāo)準(zhǔn)液比較，可求其含氮量。如測(cè)血清蛋白，可將總氮量減去非蛋白氮量，再乘以6.25即得蛋白質(zhì)量。 操作1取血清或血漿0.2ml，以0.9%NaCl溶液稀釋至10ml（稀釋50倍）2取消化管1支，加入稀釋血清0.5ml，50%硫酸0.5ml, 玻璃珠1枚，在電爐上消化。3當(dāng)出現(xiàn)白霧并充滿消化管時(shí)，消化管口加玻蓋，再繼續(xù)消化3分鐘左右，冷卻，加3%H2O212滴，再消化至出現(xiàn)白霧，加蓋，繼續(xù)消化至無(wú)色透明，完全冷卻后加蒸餾水至17.5ml，再加納氏試

8、劑至25ml，混勻，與標(biāo)準(zhǔn)管比色。4標(biāo)準(zhǔn)管制備：取硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液（應(yīng)用液）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蒸餾水作空白調(diào)零，500nm波長(zhǎng)比色。5標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液（應(yīng)用液）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，取5支干凈試管操作如下試 劑（ml）12345標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨應(yīng)用液-0.81.21.62.018N H2SO40.10.10.10.10.1蒸餾水3.42.62.21.81.4混勻，各管加奈氏試劑1.5 ml, 以第1管為空白，用500nm波長(zhǎng)比色得各管光密度值，以濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得各管光密度為縱坐標(biāo)，作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。6測(cè)得測(cè)定管的光密度值，于標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出含氮量。計(jì)算 蛋白質(zhì)g %=含氮量6.25100 試劑150%硫酸

9、2. 18N硫酸溶液：取比重1.84的分析純濃硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸餾水中。3. 3%H2O24. 0.9%NaCl5. 奈氏試劑： 奈氏試劑貯存液：于500毫升錐形瓶?jī)?nèi)加入碘化鉀150克，碘110克及蒸餾水100毫升和純汞150克，振搖到碘色將變時(shí)（約15分鐘），混合液發(fā)生高熱，將錐型瓶放入冷水內(nèi)繼續(xù)振搖至棕紅色的碘轉(zhuǎn)變成帶綠色的碘化鉀汞溶液時(shí)為止。將上清液傾入2000毫升的量筒中，用蒸餾水洗滌瓶?jī)?nèi)壁及瓶?jī)?nèi)沉淀物數(shù)次，將洗液一并傾入量筒中，加蒸餾水至2000毫升。奈氏試劑應(yīng)用液：取10%氫氧化鈉溶液700毫升，加入奈氏貯存液150毫升，搖勻，用蒸餾水稀釋到1000毫升。如渾濁，可靜止

10、過(guò)夜，取上請(qǐng)液備用。6硫酸胺標(biāo)準(zhǔn)貯存液：（1毫升=1毫克氮） 取分析純硫酸銨置烤箱中110oC，干燥半小時(shí)，取出置干燥器內(nèi)待其冷卻，準(zhǔn)確稱取干燥的硫酸銨4.716克，置1000毫升量瓶中，加蒸餾水300毫升使之溶解，加純濃硫酸1毫升，再加蒸餾水至刻度。(NH4)2SO4分子量132.06；其氮占28。 故：132.0628=4.716X X=1 即4.716克硫酸銨中含氮1克 7硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液： 取硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)貯存液1.0毫升，于100毫升容量瓶中，加純硫酸0.1毫升，以蒸餾水稀釋至刻度，于帶磨口玻璃瓶中保存。（周曉慧）實(shí)驗(yàn)四 雙縮尿法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 原理凡含有兩個(gè)以上肽鍵的化合物在堿性溶液中

11、能與硫酸銅作用生成紫色或紫紅色的復(fù)合物，這一反應(yīng)稱為雙縮尿反應(yīng)。蛋白質(zhì)含有肽鍵，因而一切蛋白質(zhì)均可與雙縮尿試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，且顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，經(jīng)與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液相比，即可求出樣品中的蛋白質(zhì)含量。 操作 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取6支試管按下表配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液試 劑123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（10mg/ml）0.00.10.30.50.70.9生理鹽水（ml）1.00.90.70.50.30.1雙縮脲試劑(ml)4.04.04.04.04.04.0蛋白濃度(mg/ml)0.00.20.61.01.41.8混勻后，于37水浴中保溫15分鐘，在520nm波長(zhǎng)下比色，以第一管調(diào)

12、零，測(cè)得各管的光密度。以各管的光密度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2.樣品測(cè)定取待測(cè)蛋白樣品0.1ml，加生理鹽水 0.9ml，再加雙縮脲試劑4.0ml，于37水浴中保溫15分鐘，測(cè)其光密度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出樣品中的蛋白質(zhì)含量。 試劑 110g/L標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)凱式定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理鹽水配成濃度為10mg /ml。 2雙縮尿試劑：稱取CuSO45H2O 2.5g、蒸餾水100ml加熱助溶。另取酒石酸鉀鈉10g、碘化鉀5g，溶于500毫升蒸餾水中，再加200 g/L NaOH 300ml混合，然后將硫酸銅溶液傾入，加蒸餾水至100

13、0 ml。 3.生理鹽水（周曉慧）實(shí)驗(yàn)五 改良酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 原理蛋白質(zhì)中所含酪氨酸和色氨酸等殘基能在堿性條件下與酚試劑之磷鉬酸、磷鎢酸作用產(chǎn)生藍(lán)色化合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比的關(guān)系可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量。 操作 （一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 1取試管6支分別編號(hào)，按下表加入試劑： 試 劑（ml）123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（1mg/ml）0.00.20.40.60.81.0生理鹽水1.00.80.60.40.20.0試劑A0.90.90.90.90.90.9 混勻后置于50C水浴10分鐘，冷卻后各管加入試劑B 0.1ml，室溫放置10分鐘，各管

14、加入試劑C 3ml，立即混勻，置37C水浴箱恒溫10分鐘。冷卻后以1號(hào)管為空白，在分光光度計(jì)上以波長(zhǎng)650nm比色，讀取光密度值。 2.以各標(biāo)準(zhǔn)樣品蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，各管光密度值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）樣品測(cè)定 取試管2支，按下表加入試劑試 劑（ml）測(cè)定管空白管稀釋的待測(cè)樣品1.0-生理鹽水-1.0試劑A0.90.9 混勻后在50C水浴箱中保溫10分鐘，取出冷卻后，兩管各加試劑B 0.1ml，室溫放置10分鐘，再各加試劑C 3ml，立即混勻，置37C水浴箱保溫10分鐘，冷卻后在分光光度計(jì)上以波長(zhǎng)650nm比色讀取光密度值。 結(jié)果與計(jì)算根據(jù)測(cè)定管光密度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白質(zhì)

15、含量。注意事項(xiàng) 1.測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度應(yīng)在0.0150.110mg/ml范圍。 2.各管加酚試劑必須快速，并立即搖勻，不應(yīng)出現(xiàn)混濁。試劑 1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：稱量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙種球蛋白10mg，用生理鹽水配制成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。 2試劑A：2g酒石酸鉀鈉及100g Na2CO3溶于500ml 1mol/L NaOH中，用蒸餾水稀至1000ml。 3試劑B：2g酒石酸鉀鈉及1g CuSO45H2O分別溶解于少量水中，混合后加蒸餾水至90ml，再加10ml 1mol/L NaOH即成。 4試劑C： （1）市售的酚試劑，用1mol/L NaOH滴定相當(dāng)于2.5 mol/L H

16、Cl，按110稀釋即可。 （2）稱取Na2WO42H2O 100g及Na2MoO42H2O 25g溶于700ml蒸餾水中，加入85% H3PO4 50ml，濃HCl 100ml混勻后，置圓底燒瓶中回流10小時(shí)，加入硫酸鋰（Li2SO4H2O）150g、蒸餾水50ml及濃溴水?dāng)?shù)滴，繼續(xù)煮沸15分鐘去溴，冷卻后稀釋至1000ml，過(guò)濾，溶液應(yīng)為金黃色，置棕色瓶中保存，使用時(shí)稀釋至1mol/L。（周曉慧）實(shí)驗(yàn)六 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 原理 蛋白質(zhì)在280nm處的特征性吸收峰，是由于其中所含有的芳香族氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的，其光密度和蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，可用于蛋白質(zhì)的定量

17、。對(duì)于同樣濃度的不同蛋白質(zhì)，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，選用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)時(shí)必須注意。若樣品中含有其它具有紫外吸收的雜質(zhì)，如核酸、核苷酸等，可產(chǎn)生較大的誤差，故應(yīng)作適當(dāng)?shù)男Ｕ?。蛋白質(zhì)樣品中含有核酸時(shí)，混雜的核酸在280nm處也有吸收，對(duì)此法有一定的影響。因此，一般情況下在測(cè)定A280的同時(shí)，測(cè)定A260，計(jì)算A280/A260 的比值。如果A280/A2601.5，可忽略不計(jì)核酸的影響，A280/A2601.5時(shí)，需按下列公式計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度： 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260 操作 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 取試管8支按下表加入試劑試 劑（ml）

18、12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（1mg/ml）0.0000.5001.0001.5002.0002.5003.0004.0000.9%NaCl溶液4.0003.5003.0002.5002.0001.5001.0000.000蛋白濃度(mg/ml)0.0000.1250.2500.3750.5000.6250.7501.000混勻，選波長(zhǎng)280nm，用1cm石英比色杯，第一管為空白，分別測(cè)定各管溶液光密度值。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2樣品測(cè)定：將待測(cè)的蛋白樣品用0.9%NaCl溶液稀釋，使其濃度在蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，混勻后按上述方法測(cè)定光密度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出樣品

19、的蛋白濃度。 試劑 1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：準(zhǔn)確稱取結(jié)晶牛血清白蛋白 （精確0.001）用0.9% NaCl溶液配置成1mg/ml的溶液（需用凱氏定氮法校正）。 2. 0.9% NaCl溶液。（周曉慧）實(shí)驗(yàn)七 凝膠過(guò)濾層析分離血紅蛋白與硫酸銅 原理血紅蛋白（分子量64500）與銅溶液混合物，通過(guò)葡聚糖凝膠G-25層析柱，以蒸餾水為洗脫劑，進(jìn)行分離大分子的血紅蛋白和小分子的硫酸銅。操作1凝膠的準(zhǔn)備：葡聚糖凝膠G-25 1g，置于錐形瓶中，加蒸餾水30ml，于沸水浴中煮沸2小時(shí)（或在室溫放置6小時(shí)），待冷卻至室溫時(shí)裝柱。2裝柱：在層析管底部填少許玻璃棉，關(guān)閉玻管的出口。然后自頂部緩緩加入葡聚糖凝膠G-25

20、懸液。待底部凝膠沉積12cm時(shí)，打開(kāi)出口。當(dāng)凝膠上升至距柱頂3cm時(shí)即可。3樣品的制備：（1） 血紅蛋白的制備：取草酸鉀抗凝血2ml于離心管中，3000轉(zhuǎn)/分離心5 分鐘，棄去上清液，再用生理鹽水洗血細(xì)胞兩次。將血細(xì)胞用5倍體積蒸餾水稀釋。（2） 銅溶液的制備：將硫酸銅3.73g溶解于10ml熱蒸餾水中，冷卻后稀釋到15ml。另取檸檬酸鈉17.3g及碳酸鈉（Na2CO3H2O）10g，加水60ml，加熱使之溶解，冷卻后稀釋到85ml。之后把硫酸銅溶液緩緩傾入檸檬酸鈉-碳酸鈉溶液中。（3）取血紅蛋白稀釋液、銅溶液按2：3體積混合，作為樣品。4加樣：（1）將層析柱出口打開(kāi)，使床表面的蒸餾水流出，直

21、到床面正好露出，再關(guān)閉出口。（2）用小滴管將樣品（約0.8ml）沿柱內(nèi)壁緩緩地加于床面上，然后打開(kāi)流出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，直到床面重新露出。（3）用上述方法加入約2ml蒸餾水。當(dāng)將近流干時(shí)，反復(fù)加入多量蒸餾水，進(jìn)行洗脫，直至紅藍(lán)兩條帶分開(kāi)為止。試劑1 葡聚糖凝膠G-25。2 草酸鉀。3 生理鹽水。4 硫酸銅。5 檸檬酸鈉。6 碳酸鈉。（王魯華）實(shí)驗(yàn)八 凝膠過(guò)濾層析分離血紅蛋白與魚(yú)精蛋白原理本試驗(yàn)使用交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G-50）將血紅蛋白（紅色，分子量為64500）與二硝基氟苯-魚(yú)精蛋白，從混合液中分開(kāi)。由于它們的分子量及顏色的不同，可以觀察到血紅蛋白洗脫較快，而魚(yú)精蛋白洗脫較慢

22、。操作1凝膠的制備稱取Sephadex G-50 1g，置于錐形瓶中，加蒸餾水30ml，于沸水浴中煮沸1小時(shí)（此為加熱法溶脹，如在室溫溶脹，需浸泡3小時(shí)），取出冷卻至室溫后再行裝柱。2裝柱取直徑0.81.5cm，長(zhǎng)度1720cm的層析管，在底部填砂芯或少許玻璃棉，裝上帶有螺旋夾和細(xì)玻管的橡皮管，垂直置于鐵架上，柱中先加入少量水，充滿細(xì)玻璃管，并殘留部分水于層析管下部，以排除層析柱底部及細(xì)玻管內(nèi)的氣泡。然后關(guān)閉玻管的出口，邊輕輕攪拌以蒸餾水稀釋的葡聚糖凝膠懸浮液，邊將其自層析管頂部緩緩加入，待底部凝膠沉積12cm時(shí)，再打開(kāi)出口，一面繼續(xù)加凝膠，待凝膠上升至距玻管頂3cm左右即可停止，最后以蒸餾水

23、平衡凝膠柱。加入凝膠時(shí)速度應(yīng)均勻，并使凝膠均勻下沉，以免層析床分層，同時(shí)防止柱內(nèi)有氣泡。如層析床凝膠表面不平整，可在凝膠表面用細(xì)玻棒輕輕攪動(dòng)，再讓凝膠自然沉降，使表面平整。3樣品的制備（1）血紅蛋白（Hb）溶液的制備：取草酸鉀抗凝血2ml于離心管中，以2500r/min離心5分鐘，棄去上層血漿，用0.9NaCl 5ml洗血細(xì)胞，重復(fù)三次，每次要把血球攪起，以3500r/min離心5分鐘后盡量棄去上清液。加蒸餾水5ml，充分混勻，放冰箱過(guò)夜使沉淀的血球充分溶血，備用。（2）DNP-魚(yú)精蛋白的制備：稱取魚(yú)精蛋白0.15g，溶于10NaHCO3溶液1.5ml中（此時(shí)該蛋白質(zhì)溶液pH應(yīng)在8.59.0左

24、右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微熱的95乙醇3ml中，待其充分溶解后，立即傾入上述蛋白質(zhì)溶液中。將此管置于沸水浴中，煮沸5分鐘，冷卻后加2倍體積的95乙醇，可見(jiàn)黃色的DNP-魚(yú)精蛋白沉淀。離心5分鐘，棄去上清液，沉淀用95乙醇洗2次，所得沉淀用1ml蒸餾水溶解，即為DNP-魚(yú)精蛋白溶液，備用。（3）取血紅蛋白稀釋液0.1ml，加DNP-魚(yú)精蛋白溶液0.2ml，充分混勻，此混合液即為樣品溶液。4加樣加樣時(shí)先將層析管出口打開(kāi)，使床表面蒸餾水流出，直到床面正好露出，用下口較大的滴管，將上述樣品（約0.3ml）緩緩沿層析柱內(nèi)壁小心地加于床表面，注意盡量不使床面攪動(dòng)，然后打開(kāi)出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，

25、直到床面重新露出，重復(fù)上法加12倍于樣品體積的蒸餾水，這樣可使樣品的稀釋最小，而樣品又完全進(jìn)入床內(nèi)。當(dāng)少量蒸餾水將近流干時(shí)，加入蒸餾水使其充滿層析柱上面空間，開(kāi)始洗脫。5洗脫與收集反復(fù)加入蒸餾水洗脫，調(diào)節(jié)出口處螺旋夾，使洗脫速度在0.51.0ml分左右（約1015滴分）洗脫時(shí)可觀察到黃、紅兩條區(qū)帶逐漸分開(kāi)，當(dāng)紅色的血紅蛋白區(qū)帶到達(dá)玻管下端時(shí)，用帶刻度的離心管收集流出液，直至紅色液全部流出為止，待測(cè)。再換以另一離心管，收集黃色的DNP-魚(yú)精蛋白洗脫液，直至黃色液全部洗出為止，此液可回收重新使用。結(jié)果與計(jì)算取一試管吸取前述血紅蛋白液0.1ml，加蒸餾水至5ml作為標(biāo)準(zhǔn)管（上柱前液），取收集的血紅蛋

26、白液加蒸餾水至5ml。以蒸餾水為對(duì)照，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)管及收集管液體在540nm波長(zhǎng)處的光密度值，按下列公式計(jì)算血紅蛋白的回收率。血紅蛋白回收率（）洗脫收集液光密度值上柱前液光密度值 100試劑1 Sephadex G-502 草酸鉀抗凝血液3 0.9NaCl4 魚(yú)精蛋白5 10NaHCO36 2，4-二硝基氟苯7 95乙醇（王魯華）實(shí)驗(yàn)九 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 原理 血漿中的各種蛋白質(zhì)，它們的等電點(diǎn)都在pH7.0以下，如將它們置于pH8.6的緩沖液中電泳時(shí)，它們都解離成負(fù)離子，向正極移動(dòng)。在同一pH溶液中，由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷的數(shù)量不同以及分子大小不同，因此它們?cè)陔妶?chǎng)中的移動(dòng)速度也有差別，利用

27、這種性質(zhì)可以把各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。 醋酸纖維薄膜作為電泳支持物具有電滲小、分離速度快，區(qū)帶清晰、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。醋酸纖維薄膜電泳可將血清蛋白分為白蛋白及1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白-球蛋白等5條區(qū)帶。固定染色之后，不僅可看到清晰的色帶，并可將各帶染料溶于堿溶液中進(jìn)行定量測(cè)定，從而計(jì)算出血清中各種蛋白質(zhì)的構(gòu)成比。 操作 1準(zhǔn)備與點(diǎn)樣： （1）將薄膜切成28cm的小條，在薄膜無(wú)光澤面距端1.5cm處用鉛筆畫(huà)一橫線，表示點(diǎn)樣位置。 （2）將薄膜無(wú)光澤面向下，浸入巴比妥緩沖液中(緩沖液盛于培養(yǎng)皿中)。 （3）將充分滲透(指膜上沒(méi)有白色斑痕)的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，把膜條兩端各貼于兩塊玻片上

28、使點(diǎn)樣線駕空。 (4)吸取少量血清滴于普通玻璃板上，用X光片或加樣器的鋼口蘸取樣品，平直印于膜上，待血清全部滲入膜內(nèi)，移開(kāi)點(diǎn)樣器。 2電泳：將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時(shí)無(wú)光澤面(即點(diǎn)樣面)向下，點(diǎn)樣端置于陰極。槽架上四層紗布怍橋墊，膜條與紗布需貼緊，待平衡5分鐘后通電，調(diào)節(jié)電壓至90V，或電流為0.40.6mA/cm寬，通電1小時(shí)左右關(guān)閉電源。 3染色：通電完畢后用鑷子將薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分鐘取出，首先用自來(lái)水沖洗一下，然后立即浸入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直至背景變白為止。用濾紙吸干薄膜。 4定量：（1）取試管6支，編好號(hào)碼，分別加入0.4m

29、ol/L氫氧化鈉4ml。（2）剪開(kāi)薄膜上各條蛋白色帶，另于空白部位剪平均六小的薄牽，分別浸入上述試管內(nèi)，不時(shí)搖動(dòng)，使藍(lán)色洗出。（3）約半小時(shí)后，用分光光度計(jì)進(jìn)行比色，在650nm波長(zhǎng)下讀取各管的光密度，用空白薄膜條洗出液為空白對(duì)照。 計(jì)算 光密度總和T=A+1+2+ 各部分蛋白質(zhì)的構(gòu)成比為： 白蛋白=A/T；1球蛋白=1/T：依次類推。 臨床意義 1 正常值：白蛋白為0.540.61；1球蛋白為0040.06；2球蛋白為0070.09；球蛋白為0.100.13；球蛋白為0.170.222 肝硬化時(shí)，白蛋白顯著降低，球蛋白升高23倍。腎病綜合征時(shí)，白蛋白降低，2、球蛋白升高。 試劑 1.巴比妥緩

30、沖液（pH8.6）：巴比妥鈉12.76g、巴比妥1.66g、蒸餾水加熱溶解后再加水至1000ml（離子強(qiáng)度0.06）。 2，氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g、甲醇50 ml、冰醋酸10 ml、蒸餾水40 ml。 3漂洗液：95%乙醇45 ml、冰醋酸5 ml、蒸餾水50 ml。 40.4mol/L NaOH。（王文勇）實(shí)驗(yàn)十一 血清-球蛋白的分離、純化及鑒定 原理 為了研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能，首先要從大分子體系中分離純化這種蛋白質(zhì)，并且須保持天然蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性（即不變性）是比較復(fù)雜的，蛋白質(zhì)分離主要是利用各種蛋白質(zhì)性質(zhì)的不同，尤其是蛋白質(zhì)在不同酸、堿環(huán)境中的性質(zhì)和

31、電學(xué)性質(zhì)的差異。分離蛋白質(zhì)常用的方法有：鹽析、層析、超離心、超過(guò)濾等，根據(jù)目的要求不同，可分別采用這些方法或幾種方法配合使用。本實(shí)驗(yàn)以分離純化血清-球蛋白為例，介紹一種蛋白質(zhì)的分離純化方法。過(guò)程包括：鹽析、離心分離、凝膠層析、離子交換層析純化、濃縮和電泳鑒定等幾個(gè)步驟。 （一）鹽析法粗提蛋白質(zhì) 血清中含有清蛋白和球蛋白（a- b- g- 、球蛋白），由于它們所帶電荷不同，分子量不同，在高濃度鹽溶液中溶解度不同，因此，可利用它們?cè)谥行喳}溶液中（常用硫酸銨、硫酸鈉等）溶解度的差異而進(jìn)行沉淀分離，此法稱為鹽析法。由于各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度不一，調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同

32、的蛋白質(zhì)沉淀析出，達(dá)到分離目的。 本實(shí)驗(yàn)采用在血清中加入50%飽和度的硫酸銨，使球蛋白沉淀析出，清蛋白則仍溶解于溶液中，經(jīng)離心分離獲得沉淀部分，即為含有g(shù)-球蛋白的粗制品。 （二）凝膠過(guò)濾層析法脫鹽用鹽析法分離而得到的蛋白質(zhì)中含有大量的中性鹽，會(huì)妨礙蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化，因此必須首先去除。常用的方法有透析法、凝膠過(guò)濾層析法等。凝膠過(guò)濾層析法主要根據(jù)混合物中分子大小不同的各種物質(zhì)，隨流動(dòng)相流經(jīng)作為固定相的凝膠層析柱時(shí)，各種物質(zhì)分子擴(kuò)散移動(dòng)速度不同使混合物中各種物質(zhì)得到分離的技術(shù)。凝膠有多種，葡聚糖凝膠（Sephadex）是常用的一種人工合成的凝膠，脫鹽用sephadexG-25層析柱，它的骨架是-

33、1，6-糖苷鍵聯(lián)接成的直鏈葡聚糖，由環(huán)氧氯丙烷作交聯(lián)劑制成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚物。結(jié)果大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)）直徑大，不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔中，垂直向下移動(dòng)，速度快。而小分子物質(zhì)（無(wú)機(jī)鹽）可擴(kuò)散入凝膠顆粒網(wǎng)孔中，流經(jīng)的路程長(zhǎng)、速度慢，從而使混合物中各組分按分子大小不同的順序流出，蛋白質(zhì)先流出，無(wú)機(jī)鹽后流出，得到除去鹽的蛋白質(zhì)溶液 （三）離子交換層析純化蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)的方法很多，如各種層析方法：離子交換層析、凝膠層析、吸附層析及親和層析等；各種電泳方法：可選用制備區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳及蛋白質(zhì)結(jié)晶等。本實(shí)驗(yàn)采用DEAE-纖維素二乙基氨乙基，-CH2-CH2-N+H（CH2-CH3）2 離子交換層析

34、法進(jìn)一步純化g-球蛋白。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)所調(diào)整的溶液pH為6.5，此時(shí)溶液中的清蛋白pI 4.7、-球蛋白pI 5.06、-球蛋白pI 5.12皆帶負(fù)電荷，而r-球蛋白pI 7.3帶正電荷。DEAE-纖維素是一種陰離子交換樹(shù)脂，本身帶有正電荷，可與溶液中帶負(fù)電荷的離子結(jié)合，如-球蛋白、-球蛋白等。而帶正電荷的r-球蛋白則不能結(jié)合在樹(shù)脂上，因而在洗脫的溶液中只留有r-球蛋白，以達(dá)到純化的目的。 （四）濃縮干燥的葡聚糖凝膠顆粒內(nèi)部有孔隙容積。當(dāng)把干燥的葡聚糖凝膠顆粒投入稀的高分子溶液中時(shí)水分和低分子量物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙直到充滿為止，而高分子物質(zhì)則排阻于凝膠顆粒之外，因此，經(jīng)十

35、幾分鐘后通過(guò)離心或過(guò)濾就可分離出膨脹的凝膠顆粒，得到濃縮了的高分子溶液。 利用葡聚糖凝膠G-25型干膠吸水膨脹，而不吸入蛋白質(zhì)的特性，在已純化的-球蛋白溶液中加入適量葡聚糖凝膠G-25型干膠。離心約5分鐘（3000轉(zhuǎn)/分）。上清液即為濃縮的-球蛋白溶液。 （五）電泳法鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）利用醋酸纖維素薄膜作為電泳支持物，將未分離純化的原血清樣品點(diǎn)樣于膜上進(jìn)行電泳時(shí)，可將血清蛋白分為清蛋白、1、2、 及-球蛋白等5條區(qū)帶，而用分離純化后的-球蛋白溶液點(diǎn)樣電泳，在-球蛋白相應(yīng)位置僅呈現(xiàn)1條區(qū)帶（電泳遷移率相同），將區(qū)帶洗脫，或直接掃描，可計(jì)算出各種蛋白質(zhì)的百分含量。 操作（一）鹽析粗提：取

36、正常人血清2.0ml于小試管中，邊搖邊緩慢加入飽和硫酸銨溶液2.0ml，使之成為半飽和溶液?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄去含有清蛋白的上清液。于沉淀中加蒸餾水1.0ml，振搖使之溶解，此液即為粗提的球蛋白溶液。（二）脫鹽：1.凝膠處理：（老師準(zhǔn)備），稱取葡聚糖凝膠G-25型6.0g于小燒杯中，加100ml蒸餾水，置沸水浴1小時(shí)，并以玻璃棒輕輕攪動(dòng)以使氣泡逸出。冷卻置室溫，待凝膠大部下沉后，棄去含有細(xì)微懸浮凝膠顆粒的上清液。加蒸餾水約100ml輕輕攪動(dòng)片刻，再棄去含有細(xì)微顆粒的上清液。加0.02mol/L pH 6.5醋酸銨溶液100ml。輕攪拌片刻，待大部分凝膠下沉

37、后，棄去含有細(xì)微顆粒的上清液，再加醋酸銨溶液100ml重復(fù)處理一次，最后加入醋酸銨溶液20ml，此即為已溶脹備用的凝膠溶液。2.裝柱：取一層析管（1.520cm 或25ml堿式滴定管），垂直夾于鐵架臺(tái)上，關(guān)閉玻管出口，先加入醋酸銨溶液約10ml,打開(kāi)出口讓硫酸銨溶液充滿下部容器然后排出，以排除空氣。關(guān)閉出口，自玻管頂部緩慢加入溶脹后的葡聚糖凝膠混懸液，邊加邊攪拌，保持凝膠均勻連續(xù)地沉降，當(dāng)混懸液達(dá)玻管頂部時(shí)，打開(kāi)出口，以螺旋夾控制流速10-20滴/分，繼續(xù)加混懸液，待凝膠面上升至距玻管頂口3cm左右時(shí)即可停止，柱床面留一層液體。3.平衡：用螺旋夾控制流速8-10滴/分，用醋酸銨溶液（ pH6.

38、5）流洗平衡幾分鐘后，即可使用。凝膠管柱上端平衡液始終不少于1cm高度，不得出現(xiàn)干膠和斷層，并應(yīng)保持凝膠面平整。4.上樣：即樣品上柱，待層析液（醋酸銨溶液 pH 6.5）上端的液面剛好下降至凝膠表面時(shí)（切勿進(jìn)入空氣）將凝膠層析管下端的螺旋夾擰緊，這時(shí)將鹽析所得的球蛋白溶液用滴管小心加入層析柱內(nèi)，打開(kāi)螺旋夾，用試管收集流出的液體，當(dāng)球蛋白溶液恰好完全進(jìn)入凝膠柱上端面內(nèi)時(shí)，立即用2ml醋酸銨溶液小心沖洗管壁上的蛋白質(zhì)，然后再重復(fù)沖洗一次。5.洗脫：反復(fù)加入多量醋酸銨溶液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為10滴/分，每當(dāng)試管內(nèi)收集到1ml(約15滴)液體時(shí)，應(yīng)取1滴置磁反應(yīng)板上加入200g/L磺基水楊酸試劑檢驗(yàn)有

39、無(wú)蛋白質(zhì)流出，如有則呈白色混濁。每收集1ml換一試管，并不斷檢查蛋白質(zhì)，直到反應(yīng)呈陰性為止。再分別從每個(gè)試管各取出1滴蛋白液置磁反應(yīng)板上加入50g/L醋酸鋇，直至檢查出現(xiàn)白色的BaSO4沉淀為止，將含蛋白質(zhì)而無(wú)硫酸銨的溶液合并，此即為已脫鹽的球蛋白溶液，待進(jìn)一步純化。6凝膠的再生與保存：葡聚糖凝膠可柱內(nèi)再生，故凝膠層析柱可重復(fù)使用，每次用完后以醋酸銨溶液進(jìn)行充分洗滌，留待再用。為防止凝膠霉變，可用含0.02%疊氮化鈉的醋酸銨溶液進(jìn)行流洗后再放置。長(zhǎng)時(shí)間不用，宜將凝膠從柱內(nèi)倒出，以濕態(tài)保存，只要在其中加適當(dāng)?shù)囊志鷦┤?.02%疊氮化鈉置4oC冰箱內(nèi)，可放置幾個(gè)月至一年，不需要干燥。如凝膠柱有輕微

40、污染，則可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl的混合液處理。 （三）純化 1DEAE-纖維素處理：稱取DEAE-纖維素3.0g，加0.5mol/L鹽酸溶液45ml，攪拌后放置30分鐘，加蒸餾水250ml，攪勻，待纖維素大部分下沉后，棄去含有細(xì)微顆粒的上層液體，如此反復(fù)2-3次，用蒸餾水洗至流出液pH4.0，再加0.5mol/L氫氧化鈉溶液45ml，攪拌后放置30分鐘，棄取上層液體，再用蒸餾水洗至pH7.0，棄上層液體后加醋酸銨溶液約200ml,用1mol/L的醋酸調(diào)至pH6.5（約5ml），留待裝柱。 2裝柱：與葡聚糖凝膠層析裝柱法相同。 3.平衡：用pH6.5醋酸銨溶液、平衡

41、的方法、時(shí)間同葡聚糖凝膠層析。 4.上樣：將脫鹽收集的球蛋白溶液上柱，方法過(guò)程與脫鹽法相同。 5.洗脫：用pH 6.5醋酸銨溶液反復(fù)加入多量進(jìn)行洗脫，流速20-30滴/分，方法與上述脫鹽法相同，同樣用200g/L磺基水楊酸檢查有無(wú)蛋白流出。此次收集的即為純化的-球蛋白溶液，留待濃縮及鑒定。 6.DEAE-纖維素的再生與保存：先用1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4Ac溶液流洗幾遍，再用0.02mol/L醋酸銨溶液（pH6.5）洗滌平衡后可重復(fù)使用。 （四）濃縮 將純化后的-球蛋白溶液量其體積，每毫升加葡聚糖凝膠G-25干膠顆粒0.25g，吸收水分，搖動(dòng)2-3分鐘，離心5分鐘（3

42、000轉(zhuǎn)/分），上清液即為濃縮的-球蛋白溶液，用吸管吸至另一個(gè)小試管中，留待電泳鑒定。 （五）電泳法鑒定 1準(zhǔn)備：在28cm醋酸纖維薄膜無(wú)光澤面距一端1.5cm處用鉛筆輕劃一條線，表示點(diǎn)樣的位置。 2.浸泡醋酸纖維薄膜：將薄膜無(wú)光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖液面上，使膜條自然浸濕下沉，浸泡一般要大于2小時(shí)，最好過(guò)夜，充分浸透至膜上沒(méi)有白色斑痕。 3點(diǎn)樣：將充分浸透的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，吸取少量血清滴于玻片上，用X光片或加樣器的鋼口蘸取血清，平直印在點(diǎn)樣線上，待血清完全浸入薄膜后移開(kāi)。另點(diǎn)樣一條膜條，吸取少量已純化的-球蛋白溶液滴于玻片上，其它操作同上述血清點(diǎn)樣。注意點(diǎn)樣位置與血清薄

43、膜一致，以便比較遷移率。 4電泳：將點(diǎn)樣膜條置于電泳槽上，使點(diǎn)樣面向下，點(diǎn)樣端置于陰極，槽架上用四層濾紙或兩層紗布作橋架，膜條與濾紙需貼緊，平衡約5分鐘后接通電源，調(diào)節(jié)電壓100-110V，穩(wěn)定電流為0.4-0.6mA/cm寬膜條，通電50-60分鐘后關(guān)閉電源停止電泳。 5染色：用鑷子將電泳后的膜條取出，浸于盛有氨基黑10B 的染色液中，染色5分鐘取出，先用蒸餾水沖一下，立即按順序浸入不同杯的漂洗液中漂洗4-5次，直至薄膜背景漂凈為止，用濾紙吸干薄膜。對(duì)照觀察血清薄膜與-球蛋白薄膜兩者的電泳區(qū)帶分析結(jié)果。血清-球蛋白分離、純化及鑒定操作流程2.0ml血清加2.0ml飽和硫酸銨溶液 混勻，放置1

44、0分鐘 3000轉(zhuǎn)/分 離心10分鐘 鹽析 沉淀（球蛋白），加1ml水溶解 上清液為清蛋白部分，棄去 脫鹽 上葡聚糖凝膠柱 用0.02mol/L、pH6.5醋酸銨溶液洗脫，收集含蛋白質(zhì)部分 純化 上DEAE-纖維素柱 用0.02mol/L、pH6.5醋酸銨溶液洗脫，收集含蛋白質(zhì)部分 濃縮 用葡聚糖凝膠G-25干膠濃縮 鑒定 用醋酸纖維素薄膜電泳鑒定 注意事項(xiàng) 1由于醋酸銨是揮發(fā)性鹽類，故溶液配置時(shí)不得加熱，配好后必須密封保存，以防pH及濃度發(fā)生改變，否則會(huì)影響所分離蛋白質(zhì)純度。 2.用HCl處理DEAE-纖維素時(shí)，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則DEAE-纖維素會(huì)發(fā)生變質(zhì)。 試劑 1. 0.3mol/L醋酸

45、銨溶液（pH 6.5）：稱取醋酸銨23.13g，加蒸餾水約800ml溶解，用酸度計(jì)準(zhǔn)確調(diào)制節(jié)至pH6.5（用稀氨水或稀乙酸），再加蒸餾水定容至1000ml。 2. 0.02mol/L醋酸銨溶液（pH 6.5）：取1液用蒸餾水稀釋15 倍，在準(zhǔn)確調(diào)整至pH6.5。 3. 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4Ac溶液：稱取NaCl 87.7g，溶于0.3mol/L NH4Ac(pH6.5)中定容至1000ml。 4. 飽和硫酸銨溶液：稱取固體硫酸銨850g，加入1000ml蒸餾水中，在70-80oC攪拌促溶，室溫放置過(guò)夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。 5. 200g

46、/L磺基水楊酸 6. 50g/L 醋酸鋇：3.5ml HAc + 2.6g Ba(OH)2 + 蒸餾水至100ml。 7.0.5mol/L HCl溶液 8. 0.5mol/L NaOH溶液 9. pH8.6巴比妥緩沖液：稱取巴比妥鈉12.76g,巴比妥，1.66g 用蒸餾水加熱溶解后，再加蒸餾水至1000ml。 10氨基黑10B染液：稱取氨基黑10B 0.5g 溶解于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml及蒸餾水40ml。 11漂洗液：量取95%乙醇45ml，加冰醋酸5ml，蒸餾水50ml混勻。 12葡聚糖凝膠G-25 (SephadexG-25)。 13.DEAE- 纖維素。 14正常血清。 （

47、周曉慧）實(shí)驗(yàn)十二 動(dòng)物肝組織中核酸的提取和鑒定原理動(dòng)物組織中的核糖核酸（RNA）與脫氧核糖核酸（DNA）大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。肝組織中的核蛋白可用水提取，再用酚破壞核酸與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合鍵，并用乙醚抽提除去蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，最后用乙醇將核酸沉淀。核酸（RNA，DNA）可被硫酸水解產(chǎn)生磷酸、有機(jī)堿（嘌呤和嘧啶）及戊糖（核糖或脫氧核糖）。此三類化合物可用下列方法鑒定：磷酸 能與鉬酸試劑作用生成磷鉬酸，后者在還原劑的作用下還原形成鉬藍(lán)，常用的還原劑有氨基苯磺酸、氯化亞錫、維生素C等。H3PO4+12H2MoO4 H3PO412MoO3 +12H2O 鉬酸 磷鉬酸還原劑H3PO412MoO3

48、H3PO46MoO33Mo2O5 鉬藍(lán)嘌呤堿 能與苦味酸作用形成針狀結(jié)晶。核糖 經(jīng)與強(qiáng)酸（鹽酸或硫酸）共熱生成糠醛，后者與3，5-二羥甲苯（5-甲基-1，3-苯二酚，苔黑酚orcinol）反應(yīng)，縮合而成綠色化合物。脫氧核糖 在強(qiáng)酸中加熱可生成-羥基-酮基戊醛，后者與二苯胺作用生成藍(lán)色化合物。操作（一） 動(dòng)物肝組織中核酸的提取1將兩只小白鼠處死，剖腹取出肝臟，用清水除去血液后置于研缽中（或用兔肝2-5g）加入凈砂少許，研磨至糊狀，再加蒸餾水3ml繼續(xù)研磨3分鐘。1 再加入90%苯酚5ml，研磨10分鐘后倒入一圓底離心管中，離心5分鐘（約250r/min）。 3將上層液體移于另一圓底離心管中，加乙

49、醚2ml，管口覆蓋聚乙烯薄膜后用拇指將管口按住，用力振搖12分鐘（或用玻璃棒攪拌）。離心5分鐘后吸取全部下層液體于另一圓底離心管中。4于該管中加入95%乙醇2ml，并用玻璃棒攪拌約2分鐘，離心3分鐘后傾去上清液，沉淀即為核酸。（二）核酸的水解在核酸沉淀管內(nèi)加入5硫酸4ml搖勻，置沸水浴中加熱15分鐘，即得核酸水解液。用流水冷卻后進(jìn)行下列定性實(shí)驗(yàn)。（三）核酸組分的定性鑒定1磷酸的鑒定：取試管2支，編號(hào)，按下表加入試劑，搖勻，于沸水浴中23分鐘，觀察兩管顏色之變化。試劑（滴）測(cè)定管（U）對(duì)照管（B）核酸水解液5%硫酸鉬酸試劑4%維生素C105410542嘌呤堿的鑒定：取試管支，加入飽和苦味酸約2m

50、l，再加入核酸水解液46滴，搖勻，靜置于室溫中，觀察有無(wú)黃色針狀結(jié)晶出現(xiàn)。3核糖的鑒定：取試管兩支，編號(hào)，按下表操作。試劑（滴）測(cè)定管（U）對(duì)照管（B）核酸水解液5%硫酸拜耳氏試劑6969搖勻，于沸水浴中加熱5分鐘后，觀察兩管顏色的變化。4脫氧核糖的鑒定：取試管兩支，編號(hào)，按下表操作。試劑（滴）測(cè)定管（U）對(duì)照管（B）核酸水解液5%硫酸二苯胺試劑20402040搖勻，于沸水浴中加熱10分鐘，觀察兩管顏色的變化。注意事項(xiàng)1在制備肝勻漿時(shí)要充分研磨，破壞肝組織。2肝組織可取自小鼠、家兔或豬肝，但以兔肝效果較好。以2公斤家兔計(jì)，兔肝重70g左右，每實(shí)驗(yàn)室僅需1只家兔。3實(shí)驗(yàn)中使用乙醚、乙醇等易燃溶劑

51、，又要使用沸水浴，如用明火加熱者應(yīng)注意防火，以防發(fā)生事故。試劑190%苯酚溶液。2乙醚。395%乙醇。45%硫酸。54%維生素C溶液（已氧化變質(zhì)的維生素C不能用）。6鉬酸試劑：鉬酸銨5g溶于100ml蒸餾水中，再加入濃硫酸15ml。冷卻后加蒸餾水至1000ml，冷處保存（一個(gè)月內(nèi)不變質(zhì)）。7飽和苦味酸溶液 苦味酸約1.3g，溶于100ml蒸餾水中，靜置過(guò)夜。臨用前取上清液。8拜耳（Bial）氏試劑 稱取1.5g3，5-二羥甲苯，加入濃鹽酸500ml，再加10%氯化高鐵20至30滴。臨用前配制，冰箱保存。9二苯胺試劑 取二苯胺1g溶于100ml冰乙酸（A.R.），加入2.75ml濃硫酸。臨用前配

52、制，儲(chǔ)于棕色瓶中。（王魯華）實(shí)驗(yàn)十三 動(dòng)物組織中DNA的提取原理動(dòng)物組織中的基因DNA均以脫氧核糖核蛋白的形式存在。在濃氯化鈉（12mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，而核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化鈉（0.14mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，而核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來(lái)。將抽提得到的脫氧核糖核蛋白用SDS處理，使DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)，再用氯仿-異丙醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA溶于上層水相中，加入適量的95%乙醇，DNA鈉鹽即沉淀析出。為防止DNA酶解，提取時(shí)應(yīng)加入EDTA二鈉（乙二胺四乙酸）。得到的樣品中DNA含量可用二苯胺法定量測(cè)定。DNA分子中的