lio轉(zhuǎn)染操作步驟

1、Lipo2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞步驟Stealth?RNAiorsiRNATra nsfectio n以24孔板為例，其余規(guī)格的轉(zhuǎn)染見(jiàn)表11中板，細(xì)胞密度為30-50%適宜。注意：根據(jù)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)短決定細(xì)胞中板密度，如果轉(zhuǎn)染后需要長(zhǎng)時(shí)間后檢測(cè)，則 細(xì)胞中板密度適當(dāng)降低，已避免細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)導(dǎo)致存活降低。2第二天(24-36小時(shí)后)每個(gè)孔轉(zhuǎn)染方式如下：A將20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基中。B將1ullipo2000 溶于5OulOpti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻室溫放置 5min。C將AB兩管混合，放置20min。3轉(zhuǎn)染期間，將24孔板培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，

2、每孔400ul。將C管mix加入24孔板對(duì)應(yīng)孔中，4-6小時(shí)候換成有血清培養(yǎng)基。PlasmidDNATra nsfectio nDNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度越高，轉(zhuǎn)染效率，表達(dá)效率也越高，并且可以降低細(xì)胞毒性。1中板。貼壁細(xì)胞：0.5-2X10 5cells/well，第二天待細(xì)胞密度達(dá)到 70-80%寸轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞：4-8X105cells/well ，中板后隨即轉(zhuǎn)染。2轉(zhuǎn)染。A將0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基中。B將2ullipo2000 溶于50ulOpti-mem無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻室溫放置 5min。C將AB兩管混合，放

3、置20min。轉(zhuǎn)染期間，將24孔板培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔 400ul。將C管mix加入24孔板對(duì)應(yīng) 孔中，4-6小時(shí)候換成有血清培養(yǎng)基。Table1.CultureSharedreage ntsDNAtra nsfectio nRNAitra nsfectio n中板密度*CultureSurf.Vol.ofVol.ofDNALipofecRNALipofecvesselareaperplati ngdiluti ontami netami newellmediummedium?2000?20001000-10000cell/well96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2

4、ug0.5ul5pmol0.25ul0.5-2X10 5cell/well24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug2.0ul20pmol1.0ul1-3X105cell/well12-well4cm21ml2X100ul1.6ug4.0ul40pmol2.0ul2-3X105cell/well6-well(35mm)10cm22ml2X250ul4.0ug*10ul100pmol5ul8-10X105cell/dish60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug*20ul200pmol10ul2-3X106cell/dish10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60

5、ul600pmol30ul*:中板密度根據(jù)不同細(xì)胞不同實(shí)驗(yàn)有所不同，這里僅提的數(shù)據(jù)僅供參考* : 6孔板細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量1-2ug足以。* : 6cmdish細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量 4-6ug足以。Opti-MEM?I減血清培養(yǎng)基是EME啲改良型，其中使用了 HEPE別碳酸氫鈉進(jìn)行緩沖，并添加次黃嘌呤、胸苷、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、痕量元素和生長(zhǎng)因子.常用其作為無(wú)血清培養(yǎng)基與質(zhì)粒和lip2000分別混合。常用的報(bào)告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 （CAT,綠色熒光蛋白（GFP,熒光素酶（Lux或Luc）細(xì)胞中本身不表達(dá)以及b-半乳糖苷酶（b-gal ）在細(xì)胞中有內(nèi)源表達(dá)，需設(shè)計(jì)空白對(duì)照。當(dāng)報(bào)告基因與目的基因共

6、轉(zhuǎn)時(shí)，作為內(nèi)參，評(píng)估目的基因的轉(zhuǎn)染效率，并作為分選標(biāo)志。像293T細(xì)胞，因?yàn)榘胭N壁，換液容易導(dǎo)致細(xì)胞飄起來(lái)，所以中間不換液。轉(zhuǎn)染步驟及經(jīng)驗(yàn)（精華）一、基礎(chǔ)理論轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專(zhuān)門(mén)技術(shù)。分類(lèi)：物理介導(dǎo)方法：電穿孔法、顯微注 射和基因槍?zhuān)换瘜W(xué)介導(dǎo)方法：如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)； 生物介導(dǎo)方法：有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見(jiàn)的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。 理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目 前轉(zhuǎn)染效率最高的方法，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。三、轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)1. 血清A.DNA羽日離子脂質(zhì)體

7、復(fù)合物形成時(shí)不能含血清，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。B. 般細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)可以耐受幾個(gè)小時(shí)沒(méi)問(wèn)題，轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。C.對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用一種營(yíng)養(yǎng)豐富的無(wú)血清培養(yǎng)基OPTI-ME M培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用LIPOFECTAMINE2O0無(wú)血清培養(yǎng)基 OPTI-MEM（GIBICO很好用，有條件的話(huà)，就用它代替PBS 洗細(xì)胞兩遍，注意洗的時(shí)候要輕，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細(xì)胞，而是轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng) 板讓液體滾動(dòng)在細(xì)胞表面。如果洗的太

8、厲害，細(xì)胞又損失一部分，加了脂質(zhì)體后，細(xì)胞受影 響就更大了，死亡細(xì)胞會(huì)增多。2. 抗生素（PS抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。 這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn) 備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤(rùn)洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIF選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外，為了保證無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng)，使用比含血清培養(yǎng) 基更少的抗生素量。3.

9、細(xì)胞狀態(tài)這點(diǎn)非常重要，不要急于求成，一定要讓細(xì)胞處于最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)再做。有文獻(xiàn) 說(shuō)傳代不要超過(guò)17代。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時(shí)細(xì)胞狀態(tài)最好，不要用傳了很多代的細(xì)胞 去做，細(xì)胞的形態(tài)都會(huì)發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表 達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)?色體重組或基因調(diào)控變化等而演化。 這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。 如果隨時(shí)間發(fā) 現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率 降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果?；蛘撸瑤追N來(lái)源于經(jīng)篩選，轉(zhuǎn)染效率 較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在

10、有售。4. 細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的最佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類(lèi)型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，細(xì)胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%懸浮細(xì)胞密度為2-4 X 106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)滿(mǎn)或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。5. DNA量高質(zhì)量的DNA寸于進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一定純度好、濃度高、無(wú) 內(nèi)毒素。濃度不要低于 0.35ug/ul。產(chǎn)物表達(dá)：48小時(shí)mRN表達(dá)最高；72h蛋白表達(dá)最高。6. 瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)及監(jiān)測(cè)基因的瞬時(shí)表達(dá)在24-72小時(shí)內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時(shí)表達(dá)非常適