醋酸纖維薄膜電泳

1、醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì),一、目的 掌握醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白的原理和 方法 二、原理 血清中含有多種蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)均低于pH7.0 在pH 8.6的緩沖液中，它們電離出負(fù)離子，帶正電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng) 各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，在同一pH值下所帶電荷量不同 分子的大小不同，因此在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同，這樣可將各種血清蛋白質(zhì)分離開,三、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備 1、樣品：新鮮牛血清（無(wú)溶血） 2、儀器：DYY-2型常壓電泳儀、臥式電泳槽 3、器材：醋酸纖維薄膜(82cm) ；點(diǎn)樣器；培養(yǎng)皿； 濾紙；直尺、鉛筆；鑷子；剪刀；和鉛筆 4、試劑：pH8.6巴比妥-巴比妥鈉緩沖液 漂洗液 染

2、色液,四、操作步驟 1、膜的潤(rùn)濕和選擇 迎著光辨別無(wú)和有光澤面，用鑷子將薄膜無(wú)光澤面向下，置巴比妥緩沖液中，自然浸泡30min 選擇薄膜顏色一致而無(wú)白色斑點(diǎn)的膜 2、制作電橋 將電泳槽置于平臺(tái)上，將緩沖液倒入電泳槽內(nèi)，使兩槽緩沖液平衡至同一水平面 于兩電極槽各放入2層紗布，一端浸人緩沖液中，另一端貼附在電泳槽支架 當(dāng)紗布全部潤(rùn)濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的紗布以驅(qū)趕氣泡,四、操作步驟 3、點(diǎn)樣 點(diǎn)樣模板的制作 取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，無(wú)光面朝上放在點(diǎn)樣模板上 在點(diǎn)樣器上均勻地沾上血清，將點(diǎn)樣器輕輕地印在點(diǎn)樣區(qū)內(nèi) 4、電泳 將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上

3、，另一端平貼在陽(yáng)極端支架上 連接好電泳儀，接通電源，調(diào)節(jié)電壓為100V，電流為0.6 mA2n，電泳60min,四、操作步驟 5、染色與漂洗脫色 染色:電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡10min 漂洗脫色:將膜條從染色液中取出后，移置到漂洗液中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直至背景漂凈為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜 五、記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果 把電泳圖譜畫在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上 并指出每條區(qū)帶的種類,六、注意事項(xiàng) 1、薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一 2、點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸 去，吸水量以不干不濕為宜 3、點(diǎn)樣時(shí)，動(dòng)作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免 損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果 4、

4、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的無(wú)光面上，點(diǎn)樣量要適量 5、電泳時(shí)將薄膜的點(diǎn)樣端置于負(fù)極端，且點(diǎn)樣面 向下 6、控制染色時(shí)間 7、過(guò)程為防止指紋污染，應(yīng)戴手套,七、思考題 1、電泳圖譜清晰的關(guān)鍵是什么？如何正確操作？ 2、電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的正極還是負(fù)極？ 為什么,尿中17-羥皮質(zhì)類固醇的測(cè)定,相關(guān)知識(shí) 1、電泳 帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳(electrophoresis，EP ) 電泳是對(duì)混合物中帶電離子的分離和鑒定技術(shù) 2、基本原理 電荷的來(lái)源：由于本身的解離作用或表面上吸附其它帶電質(zhì)點(diǎn)，在電場(chǎng)中會(huì)向一定電極移動(dòng) 遷移率 ：帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的電泳速度 其泳動(dòng)速度與

5、所分離的物質(zhì)所帶的凈電荷的數(shù)量、顆粒的大小和形狀有關(guān),10,3、影響電泳遷移率的因素 電場(chǎng)強(qiáng)度 溶液pH 溶液的離子強(qiáng)度 溫度 電滲 支持物,電泳的分類,按原理分 區(qū)帶電泳：在電泳過(guò)程中，不同離子成分在均一的緩沖液體系分離成獨(dú)立的區(qū)帶 移界電泳：是在U型管中進(jìn)行的電泳 等速電泳：當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各區(qū)帶相隨分出清晰的界面，并以等速移動(dòng) 等點(diǎn)聚焦：由于不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)中，自動(dòng)形成pH梯度，使被分離物移動(dòng)到各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶,電泳的分類,按有無(wú)支持物分 自電泳：在溶液中進(jìn)行的一種電泳技術(shù) 區(qū)帶電泳：有支持物的電泳 紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠

6、電泳 圓盤電由泳、平板(垂直、水平)電泳、柱電泳,什么是醋酸纖維素薄膜 醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙?；?厚度約以0.1-0.15mm 什么是醋酸纖維素薄膜電泳 以醋酸纖維素薄膜為支持物的電泳,醋酸纖維素薄膜電泳的特點(diǎn) 吸附作用小，分離效果好 快速省時(shí) 靈敏度高，樣品用量少 應(yīng)用面廣 易保存，易定量,產(chǎn)品名稱：雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀 產(chǎn)品型號(hào)：DYY-6C型,5-600V 4-400mA 240W,臥式電泳槽,醋酸纖維薄膜電泳裝置示意圖,1、濾紙橋； 2、電泳槽； 3、醋酸纖維素薄膜； 4、電泳槽膜支架； 5、電極室中央隔板,醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖,虛線處為點(diǎn)樣位置,血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜示意圖,1、清蛋白，2、1球蛋白 3、2球蛋白 4、球蛋白 5、球蛋白 6、為點(diǎn)樣原點(diǎn),點(diǎn)