DNA提取實(shí)驗(yàn)報告

1、生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)（二）實(shí)驗(yàn)名稱：質(zhì)粒擴(kuò)增、提取和鑒定實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過對智力擴(kuò)增、提取和鑒定試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理介紹和實(shí)際操作，加深對分子生物學(xué)基本技術(shù)的理解和掌握。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、離心機(jī)、不同型號移液槍若干支、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、電爐、制冰機(jī)、瓊脂糖凝膠電泳儀、超凈工作臺等。實(shí)驗(yàn)原理：質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，通過對細(xì)菌、放線菌和真菌的培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)對質(zhì)粒的擴(kuò)增。經(jīng)過處理的線狀dna在外界環(huán)境恢復(fù)正常的時候不能夠復(fù)性 而質(zhì)粒dna可以復(fù)性，從而可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒dna和染色體dna的分離。限制性內(nèi)切酶能特意地結(jié)合于一端被稱為限制性酶識別系列的dna系列之內(nèi)或其附近

2、的特異位點(diǎn)上，并切割dna。當(dāng)對提取的質(zhì)粒dna進(jìn)行電泳時，同一質(zhì)粒dna其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。實(shí)驗(yàn)步驟：一 質(zhì)粒擴(kuò)增（1）普通lb固體培養(yǎng)基制備：制備lb培養(yǎng)基，倒入滅菌瓶中高壓滅菌，待完全冷卻后，保存?zhèn)溆谩＃?）將大腸桿菌接種于lb培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜(200轉(zhuǎn)/分)二 質(zhì)粒dna的提取(堿法)1將菌液倒入1.5ml的微量離心管中， 12000rpm離心一分30秒，棄去上清液，以得到較多的細(xì)菌沉淀；2、 將微量離心管開口倒置在衛(wèi)生紙上，使離心管底部的液體流盡。3、 加入100l用冰預(yù)冷的溶液i，劇烈振蕩，將沉淀徹底懸浮，然后室溫放置5分鐘。4、 加入2

3、00l現(xiàn)配的溶液ii，蓋緊管口，輕輕快速顛倒離心管（不要振蕩，以避免dna斷裂），使混合物混勻，冰浴510分鐘。5、 加入150l預(yù)冷的溶液iii，蓋緊管口，溫和顛倒混勻，使粘稠地細(xì)菌裂解物均勻地分布于溶液iii中，冰浴5分鐘。6、 取上部水相，移入新的離心管，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇（也可同時加入1/10倍體積的醋酸鈉），震蕩混勻，室溫放置10分鐘沉淀雙鏈dna，然后4，12000rpm離心10min。7、 棄去上清液，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使離心管底部的液體流盡后，加 入預(yù)冷的1ml 70乙醇。8、棄去上清液，將離心管倒置于衛(wèi)生紙上，使液體流盡，置dna干燥510分鐘。9、吸除上清液，

4、將管口倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。10 、 將沉淀溶于34lte緩沖液或滅菌水（ph8.0）中，儲于-20冰箱中三dna酶切反應(yīng)1、 將潔凈干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf 管（最好0.5ml）編號，用微量移液槍分別加入dna（l）和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10緩沖液2l，將管內(nèi)溶液混勻后加入0.5l酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可以用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。2、 混勻反應(yīng)體系后，將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7

5、水浴鍋保溫2-3小時，使酶切反應(yīng)完全。3、 每管加入2l0.1mol/l edta（ph8.0），混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱之保存?zhèn)溆?。?dna的瓊脂糖凝膠電泳1、 取5tbe緩沖液100ml加蒸餾水至1000ml，配成0.5tbe稀釋緩沖液，待用。2、 膠液的制備：稱取3g瓊脂糖置于1000ml錐形瓶中，加入300ml 0.5tbe稀釋緩沖液，加入微波爐里加熱至瓊脂糖全部融化，取出搖勻，此為1%瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使其附于瓶蓋上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時應(yīng)蓋上封口膜，以減少水分蒸發(fā)。3、 膠版的制備：想冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠（eb）溶液使其終濃度為0.

6、5lg/ml。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則溶液出現(xiàn)氣泡，待膠完全凝固后，拔出梳子注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5tbe稀釋緩沖液至頁面恰好沒過膠板上表面4、 加樣：取20l的酶解液與2l10載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中，每加完一個樣品要更換tip頭以防止互相污染，注意上樣時要小心操做，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿5、 電泳：加完樣后合上電泳槽蓋，立即接通電源，控制電壓保持在60-80v，電流在40ma以上，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿2cm時停止電泳6、 觀察和拍照五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果六 實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過本次試驗(yàn)加深了對分子生物學(xué)以及基因工程

7、的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的結(jié)果。結(jié)果顯示，第三條中酶切效果良好，rna被降解的很完全，第四根沒有被酶切，質(zhì)粒dna跟rna同時存在，出現(xiàn)了兩條亮帶，質(zhì)粒dna跟rna分離效果較好。本實(shí)驗(yàn)需要細(xì)致認(rèn)真的完成，所以特別在凝膠電泳中要十分注意以下事項：（1） 取出梳子之前，一定要耐心等待瓊脂糖凝膠的凝固，拔梳子是一定要手穩(wěn)，而且要垂直拔出；（2） 點(diǎn)樣要細(xì)心，槍頭不要碰到凝膠，以免點(diǎn)樣槍刺破凝膠；（3） 電泳時，電極一定要連接正確（4） 染色劑溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，有致癌性和強(qiáng)毒性，使用時一定要帶一次性手套，使用后廢液不可不可隨意丟棄。生物科學(xué) 071班 姓名：劉歡 學(xué)號：20073305篇

8、二：dna的提取和電泳實(shí)驗(yàn)報告基因組dna的提取和電泳（實(shí)驗(yàn)五）實(shí)驗(yàn)報告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈊na提取的方法，以及瓊脂糖凝膠電泳分析dna技術(shù)。二、器材和試劑1. 器材水平瓊脂糖電泳儀，離心機(jī)，水浴鍋，研缽，離心管、移液槍、水稻幼苗等2. 試劑1. 1mol/l tris.cl(ph8.0) 的配制：稱取12.11g 的tris，置于80 ml的ddh20,加入濃鹽酸（約4.2 ml）,調(diào)節(jié)ph值至8.0，定容至100 ml。2. 0.5 mol/l edta(ph8.0)的配制：18.61g na2edta2h2o，加入80 ml的ddh2o,用naoh顆粒調(diào)ph值至8.0（約需2 g），定容至

9、100 ml。3. 提取緩沖液的配制： 100 mmol/l tris.cl(ph8.0), 20 mmol/ledta, 500 mmol/l nacl,1. 5%sds4. 80/4/16氯仿：異戊醇：乙醇5. 6?loading buffer：0.15溴酚藍(lán)，0.15二甲苯青ff，5 mmol/l edta，50甘油三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 在15ml的離心管中加入5ml的提取緩沖液，60水浴預(yù)熱。2. 植物葉1-2g，剪碎，在缽體中加入石英砂，加入預(yù)熱的提取緩沖液，磨成粉末狀，60水浴保溫20 min，其間不時緩慢搖動。3. 5000 rpm離心5分鐘，仔細(xì)吸取上清液至另一離心管中，4. 加入

10、5 ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻（需帶手套，防止皮膚損傷），室溫下靜置5-10分鐘，使水相和有機(jī)相混勻。5. 室溫下離心5000 rpm離心5分鐘。6. 仔細(xì)吸取上清液至另一離心管中，加入一倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀沉淀。7. 離心5000 rpm，離心5 min，棄去異丙醇，室溫晾干。8. 視沉淀多少，加入1ml左右ddh2o溶解，可在60水浴中放置15分鐘以上助溶。9. 取dna樣品5 l，加入1 l6?loading buffer，混勻，加入0.7%的瓊脂糖凝膠加樣孔中，電泳，檢測dna的分子大小。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論實(shí)驗(yàn)分析：本次實(shí)驗(yàn)由于種種原因我是和植保102

11、班的同學(xué)一起做的，我們組3人，實(shí)驗(yàn)過程比較嚴(yán)謹(jǐn)，受到了老師的表揚(yáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也很令人滿意。下面是實(shí)驗(yàn)過程中的注意點(diǎn)：1、研磨不能太久太用力，會導(dǎo)致dna片段斷掉。2、實(shí)驗(yàn)室的某些試劑，如氯仿，有毒性，應(yīng)帶手套進(jìn)行。電泳的時候不知是時間的原因還是都做得不錯，結(jié)果相差不是很遠(yuǎn)（如上圖），第五組和第六組是我們的，第六組是我自己加的。實(shí)驗(yàn)過程中要耐心細(xì)心，這樣才能得到滿意的結(jié)果。園藝101石穎20100107011篇三：浙大生化實(shí)驗(yàn)報告dna的提取實(shí)驗(yàn)報告課程名稱： 生化實(shí)驗(yàn)甲 指導(dǎo)老師： 成績：_ 實(shí)驗(yàn)名稱：植物基因組dna的提取 實(shí)驗(yàn)類型： 生化定性實(shí)驗(yàn) 同組學(xué)生姓名： 及純度與含量的測定 一、實(shí)驗(yàn)

12、目的和要求（必填） 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填） 三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填） 四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填） 五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填） 六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理 七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填） 八、討論、心得 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1、學(xué)習(xí)并掌握植物基因組dna的提取原理和方法； 2、了解瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的原理和操作； 3、學(xué)習(xí)并掌握對電泳檢測基因組dna結(jié)果的初步分析； 4、學(xué)習(xí)紫外吸收法測定核酸基本原理和方法； 5、學(xué)習(xí)并掌握紫外吸收法測定基因組dna純度與含量的方法。 二、實(shí)驗(yàn)基本原理 植物基因組dna的提取方法就其提取原理主要有二種：十六烷基三乙基溴化銨（ctab)法、十二烷基硫酸鈉 (

13、sds)法。十六烷基三甲基溴化銨和十二烷基硫酸鈉等離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使dna得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(dna、rna)水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使dna沉淀，沉淀dna溶于te溶液中，即得植物基因組 dna溶液。由于植物中的次生代謝產(chǎn)物多酚類化合物可介導(dǎo)dna降解，而多糖的污染也是影響植物核酸純度最常見的問題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及dna聚合酶等分子生物學(xué)酶類的生物活性。傳統(tǒng)的ctab-dna提取法步驟多，較煩瑣，dna產(chǎn)率低，而且由

14、于酚很難完全去除，容易影響以后的酶切等工作的效率。sds法操作簡單，溫和,也可提取到較高分子量dna，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多,這將直接影響dna的限制性核酸內(nèi)切酶酶切效果。由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對dna的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強(qiáng)還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。本實(shí)驗(yàn)采用十二烷基硫酸鈉 (sds)法提取植物基因組dna，基因組dna提取后， 通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組dna分子量大小、純度；用紫外吸收法測定基因組dna純度與含量。dna的瓊脂糖凝膠電泳鑒定:dna分子在瓊脂糖凝膠中有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。dna分子在高于等電點(diǎn)的溶

15、液中帶負(fù)電荷，它在電場中向正極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，dna分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即具有不同的相對分子量的dna片段泳動速度不同。dna片斷在凝膠中當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（eb）染色后，在紫外光下可見橙紅色帶，并可確定dna片斷在凝膠中的位置。紫外吸收法測定基因組dna純度與含量核酸dna和rna所含堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)（嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)）的共軛雙鍵具有紫外吸收的性質(zhì)，它們在260nm處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長進(jìn)行核酸含量的測定。波長為260nm時，dna或rna的光密度的大小不僅與總含量有關(guān)，也與它們的不同構(gòu)型而有差異。對標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1g / ml時，

16、dna鈉鹽的od2600.02。當(dāng)od2601時，雙鏈dna含量約為50g / ml單鏈dna含量約為37g / mlrna含量約為40g / ml寡核苷酸含量約為30g / ml（由于底物不同有差異）1、核酸樣品dna、rna含量的測定：如用1cm光徑石英比色皿，用 h2o稀釋dna或rna樣品n倍并以h2o為空白對照，根據(jù)此時讀出的od260值即可計算出樣品稀釋前dna的含量：dna（g/l）=50od260讀數(shù) dna樣品稀釋倍數(shù)/1000rna（g/l）=40od260讀數(shù) rna樣品稀釋倍數(shù)/1000若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時無法用分光光度法對核酸進(jìn)行定量，可使用溴化乙錠法或其

17、他方法進(jìn)行估算。當(dāng)dna樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時，會影響dna吸光度的準(zhǔn)確測定。由于 dna在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。所以，一般情況下同時檢測同一樣品的od260、od280和od230，計算它們的比值來判斷核酸樣品的純度。2、核酸樣品純度判斷的一般標(biāo)準(zhǔn)： dna純度：od260/od2801.8，表示為純的dna；od260/od280 1.9，表示有rna污染；od260/od280 1.6，表示有蛋白質(zhì)、酚等污染。 rna純度：1.7 od260/od2802.0，表示為純的rna；od260/od2

18、80 1.7時，表示有蛋白質(zhì)或酚污染；od260/od280 2.0時，表示可能有異硫氰酸殘存。 od230/od260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時無法用分光光度法對核酸進(jìn)行定量；同時也會影響酶切和pcr的效果。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料：植物幼嫩葉子2、實(shí)驗(yàn)試劑（1）基因組dna提取緩沖液（2）氯仿:異戊醇:乙醇抽提液（3）te緩沖液（4）平衡酚：（5）rna酶a（6）酚/氯仿（7）氯仿/異戊醇（8）異丙醇、無水乙醇、70%乙醇。（9） 3mol/l naac（10） 5tbe緩沖液（11）

19、6電泳上樣緩沖液（12） 1.0%瓊脂糖凝膠（13） eb（14） dna分子量markers：125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.（15） ddh2o；四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、研體2、離心機(jī)、離心管（7ml、5ml）及離心管架；3、微量移液器10ul、200ul、1000ul及槍頭；4、恒溫水浴箱65 5、制冰機(jī)；6、冰箱；7、恒溫水浴箱 37；8、微波爐；9、電泳儀及電泳槽；10、紫外檢測儀。11、紫外分光光度計；12、石英比色皿（0.5cm光徑）或1cm光徑的微量石英比色皿（50ul、100ul）。（二）瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組dna1、制膠（

20、1瓊脂糖凝膠）（此步驟由實(shí)驗(yàn)室老師準(zhǔn)備）在膠模上架好梳子。稱取01g瓊脂糖，置于250ml錐形瓶中，加100ml 0.5tbe電泳緩沖液，加熱熔化至無顆粒狀瓊脂糖，待其冷卻至5060后，加入eb，使其終濃度為0.5mg/l，搖勻后立即倒入準(zhǔn)備好的膠模中，待膠凝固后，放入電泳槽中，倒入適量0.5tbe（剛好淹過膠面），拔去梳子備用。（注：eb為誘變劑、致癌物，接觸凝膠必須戴手套操作）2、加樣取5ul純化的dna原溶液樣品，與1ul 6電泳加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中（注：勿劃破或戳穿加樣孔，勿帶入氣泡）。若dna含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加

21、完一個樣品要換槍頭以防互相污染。注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。3、電泳加完樣后，蓋上電泳槽蓋，立即接通電源，使電壓調(diào)到100v，恒壓電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前緣約2cm時，停止電泳（約需3060min）。4、觀察和拍照取出膠塊置于紫外燈下觀察，dna存在處可顯示出肉眼可辨的橘紅色熒光帶，再用成像儀進(jìn)行拍照，以便于分析。（注：紫外光對眼睛有害，觀察時戴上防護(hù)鏡或眼鏡，或隔著玻璃或有機(jī)玻璃觀察）。 紫外吸收法測定基因組dna純度與含量將提取的植物基因組dna樣品吸取20ul，加到新的5ml離心管中，再加一定量的ddh2o 或te緩沖液（ph 8.0）稀釋100倍，

22、用0.5cm光徑石英比色皿（約需1.6ml樣品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度計上測定230nm、260nm、280nm處的吸光度。計算植物基因組dna樣品溶液的dna的含量以及dna樣品的純度。六、結(jié)果與分析（一）這是電泳后得到的照片，其中從右往左數(shù)第七條帶為我所做樣品的基因組。（二）紫外吸收法測定基因組dna純度與含量1、植物基因組dna樣品溶液的dna的含量：dna（g/l ）=959.328ng/ul2、植物基因組dna樣品溶液的dna的純度：od260/od2801.97od230/od2602.073、樣品純度判斷： od260/od280 1.8，表示為純的dna； od26

23、0/od280 1.9，表示有rna污染； od260/od280 1.6，表示有蛋白質(zhì)、酚等污染。由od260/od2801.97可知，樣品含有rna雜質(zhì)。七、討論、心得注意事項：影響dna泳動速率（遷移率）的因素有： dna分子質(zhì)量的影響：雙鏈dna分子遷移的速率與dna分子量對數(shù)成反比。分 子量越大，遷移率越小。 dna構(gòu)型的影響：超螺旋dna線狀dna開環(huán)dna 膠濃度的影響： 濃度越低，相同核酸分子遷移越快，一般常用的凝膠濃度為12； 電場強(qiáng)度的影響：電場強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，（一般5v/cm）（電場強(qiáng)度） 。

24、而對于大片段電泳，甚至用0.51.0v/cm電泳過夜。進(jìn)行高壓電泳時，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。 eb的影響：溴化乙錠（eb）插入雙鏈dna造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。 電泳緩沖液的影響:核酸電泳常采用tae、tbe、tpe三種緩沖系統(tǒng)，但它們各有利弊。tae價格低廉，但緩沖能力低，必須進(jìn)行兩極緩沖液的循環(huán)。tpe在進(jìn)行dna回收時，會使dna污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以多采用tbe緩沖液。在緩沖液中加入edta，可以鰲合二價離子，抑制dnase，保護(hù)dna。緩沖液ph常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負(fù)電，向正極移動。 堿基組成與電泳溫度的影響: 一般影響不大在dna提取過程中必須始終注意

25、以下幾個關(guān)鍵問題：（1）dna的二級結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、低鹽濃度、有機(jī)溶劑、酰胺類、尿素等）的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時避免使用變性的條件。（2）抑制內(nèi)外源dnase的活力。dnase就象一把刀，它能把大分子的dna切成碎片，所以要加以杜絕，現(xiàn)可以通過多種途徑來做到這一點(diǎn)：a、低溫操作；b、調(diào)節(jié)ph，使偏堿（ph8.0）；c、抽提液中加表面活性劑；d、加螯合劑（edta）除去酶的鋪助因子（mg2+），使酶活性喪失。（3）防止化學(xué)降解。如過酸或過堿以及其它化學(xué)因素，會使dna降解，一般綜合考慮，取ph8.0左右為宜。（4）防止物理因素降解。如溫度太高或機(jī)械張

26、力剪切等，dna分子特別大，極易被機(jī)械張力拉斷，甚至在細(xì)管中稍急一些的流動也會使dna斷裂，所以在抽提過程中要特別注意這一點(diǎn)，操作過程要盡量簡便、溫和、減少攪拌次數(shù)，也不要劇烈搖動。（5）植物的次生代謝物（主要是胞質(zhì)內(nèi)的多酚類或色素類化合物）對核酸提取有干擾作用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取dna的材料，這是因幼嫩的新生組織次生代謝物較少，dna含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鮮的。由結(jié)果可知，在加入rna酶的時候可適當(dāng)多加一點(diǎn)，以免造成得到的dna樣品含較多rna雜質(zhì)。篇四：dna提取實(shí)驗(yàn)報告注：1、報告內(nèi)的項目或內(nèi)容設(shè)置，可根據(jù)實(shí)際情況加以調(diào)整和補(bǔ)充。2、學(xué)生提

27、交實(shí)驗(yàn)報告時間為實(shí)驗(yàn)后10日內(nèi)。篇五：dna提取及pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)報告pcr擴(kuò)增及dna瓊脂糖凝膠電泳劉琳 1131428 環(huán)境科學(xué)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握pcr擴(kuò)增的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2對擴(kuò)增后的dna進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，并分析相應(yīng)結(jié)果。二、實(shí)驗(yàn)原理1. pcr擴(kuò)增多聚酶鏈反應(yīng)（pcr）技術(shù)的原理類似于dna的天然復(fù)制過程。在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板dna、四種脫氧核苷酸（dntp）、耐熱t(yī)aq聚合酶及兩個合成dna的引物，而后加熱使模板dna在高溫下（94）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶液溫度，使合成引物在低溫（55）與模板dna互補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是所謂

28、退火階段。溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72），在tap酶作用下，用四種dntp為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板dna的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫退火和dna合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物dna重復(fù)合成，并在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物dna可作為后一循環(huán)的模板dna而參與dna的合成，使產(chǎn)物dna的量按指數(shù)方式擴(kuò)增。經(jīng)過3040個循環(huán)，dna擴(kuò)增即可完成。2. dna瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)dna分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，dna分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。d

29、na分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的dna分子的遷移速度不同。該電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用dna分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。三、實(shí)驗(yàn)材料儀器：pcr擴(kuò)增儀、0.2ul薄壁管、1.5ml離心管、移液槍、槍頭、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、制膠版、紫外透射儀。試劑： tapdna聚合酶、dntp、buffer、兩種引物、16s全長dna樣本、無菌ddh2o、模板dna 、tbe、瓊脂糖、eb、顯色劑。四、 實(shí)驗(yàn)步驟1. pcr擴(kuò)增本次試驗(yàn)選擇細(xì)菌16s rdna v3區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增。1.1. 根據(jù)計算，首先取1.5ml離心管按照2.5ul 10bu

30、ffer 、1 ul dntp、0.5 ul 341gc、0.5 ul 534、0.125 ul taq、19.375u ddh2o的比例配置足量的pcr反應(yīng)體系。1.2. 分別向9個薄壁管中分別加入24 ul的反應(yīng)體系，并分別添加8種不同的模版，并于第9個薄壁管中加入無菌ddh2o作為陰性對照。1.3. 將薄壁管放入pcr擴(kuò)增儀中，按照預(yù)定程序進(jìn)行pcr擴(kuò)增。其中循環(huán)過程需要達(dá)到3040次。程序如下：預(yù)變性： 94 3min循環(huán)： 94 變性30s55 退火30s72 延伸30s末次延伸：72 5min1.4. pcr擴(kuò)增完成后，將樣品取出并保存于15環(huán)境中。2. dna瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)3

31、. 1稱取0.2g瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的0.5tbe電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。搖勻，待冷卻至60左右，在膠液內(nèi)加入適量的eb。2.2 取有機(jī)玻璃制膠板槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。2.3 待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。2.4 在槽內(nèi)加入0.5tbe電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。取1l緩沖液和5l待測dna樣品混合后，用移液槍滴加至凝膠的加樣孔中。2.5 接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出，電壓最高不超過5v/cm，開始電泳。點(diǎn)樣端放陰極端。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)電壓使分帶清晰。

32、2.6 觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動。當(dāng)其移動至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳。2.7 在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈，通過觀察孔進(jìn)行觀察。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論如圖所示：從左至右，分別是模版1-8號，第9列為陰性對照。前8列均有明顯的條帶出現(xiàn)，而陰性對照無顯示，說明擴(kuò)增整體效果很好。圖中有上下兩條線，上面一條線所覆蓋的條帶基本可以代表擴(kuò)增的產(chǎn)生的片段位置，參照圖可以看出擴(kuò)增片段在200bp左右。在第9個陰性對照的第二條線處可以看到較為模糊的條帶，并非是出現(xiàn)假陰性，而是由于二聚物而產(chǎn)生的條帶。通過該條帶與最右側(cè)的marker對比可知該片段出現(xiàn)在100bp左右，并非由于實(shí)驗(yàn)操作等問題而產(chǎn)生的污染。實(shí)驗(yàn)的照片顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果有拖尾現(xiàn)象，但是并不影響后續(xù)