酵母表達(dá)系統(tǒng)

1、三、酵母表達(dá)系統(tǒng),二、酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng),四、絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng),三 酵母表達(dá)系統(tǒng),甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng),釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng),其它酵母表達(dá)系統(tǒng),一） 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng),釀酒酵母分泌系統(tǒng),釀酒酵母系統(tǒng)啟動子,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)存在的問題,釀酒酵母糖基化系統(tǒng),1、釀酒酵母啟動子,UAS,URS,TATA,起始位點,編碼序列,mRNA,40-120bp,20-40bp,100-1400bp,1、轉(zhuǎn)錄起始位點； 4、URS：上游阻遏序列 2、TATA盒：富含AT； 5、DAS：下游激活序列 3、UAS：上游激活序列,DAS,1）糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的強(qiáng)啟動子，受葡萄糖誘導(dǎo)： 甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH 磷酸甘

2、油激酶基因PKG 乙醇脫氫酶基因ADH,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)常用啟動子,2）半乳糖激酶啟動子（GAL1,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因連鎖在一起，獨立轉(zhuǎn)錄，共同調(diào)控 B、GAL4產(chǎn)物與UAS結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄；GAL80產(chǎn)物抑制GAL4產(chǎn)物的活性，阻遏轉(zhuǎn)錄 C、野生型GAL4表達(dá)水平低，產(chǎn)物活性可被GLAL80產(chǎn)物完全抑制，半乳糖誘導(dǎo)效果差,半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制,2）半乳糖激酶啟動子（GAL1,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,A、 將GAL4的啟動子換成GAL10的誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子 B、半乳糖誘導(dǎo)G

3、AL4高表達(dá)，不受GAL80產(chǎn)物抑制，激活GAL1等高效轉(zhuǎn)錄,半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制,Promoter,GAL10,3）pho4TS-PHO5啟動子,A、PHO5啟動子在培養(yǎng)基缺磷酸鹽時啟動轉(zhuǎn)錄 B、PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動子的正調(diào)控因子,C、pho4TS 溫度敏感，35時失活，PHO5關(guān)閉,D、pho4TS-PHO5啟動子通過降溫（23）誘導(dǎo)表達(dá),低溫誘導(dǎo)、磷酸鹽抑制,釀酒酵母系統(tǒng)常用分泌信號肽來源： 性結(jié)合因子：MF- 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 殺手毒素因子：KIL,2、釀酒酵母分泌系統(tǒng),保守性低，大多異源宿主系統(tǒng)的信號肽不能互用 *信號肽結(jié)構(gòu),釀酒酵母信號肽特點

4、,正電荷區(qū),疏水區(qū),極性區(qū),Met,目的蛋白,信號肽剪切位點,分泌效率高 *在酵母系統(tǒng)具有通用性 *88個殘基組成,MF-信號肽,Met,目的蛋白,Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala,KEX2,DAP,DAP,DAP：STE13編碼的二肽酶,糖基化位點：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天門冬酰氨酸殘基上的酰胺氮進(jìn)行糖 基化，對蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。 O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進(jìn)行糖基化,3、釀酒酵母糖基化系統(tǒng),過糖基化（超糖基化修飾）： N型或O型糖基的外鏈進(jìn)一步形成龐大的、由甘露糖組成的、復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。增加了免疫原性、對

5、活性與藥代穩(wěn)定性均有影響。 *糖鏈組成 O型糖鏈僅由甘露糖組成、而哺乳細(xì)胞的還含唾液酸基團(tuán),釀酒酵母糖基化特點,1）表達(dá)水平普遍不高 A、表達(dá)載體傳代不穩(wěn)定（YEp、YRp） B、所采用的強(qiáng)啟動子調(diào)控不嚴(yán)謹(jǐn) C、不能利用簡單的無機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵 2）分泌表達(dá)產(chǎn)物過糖基化,4、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺陷,二） 甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng),甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子,甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用,甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)操作原理,甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素與對策,甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點,1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子,甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作單一碳源的一類酵母。 畢赤酵母

6、（Pichia pastoris) 漢森酵母（Hansenula ploymorpha) 假絲酵母（Candia boidinii,1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子,甲醇氧化酶 A、甲醇代謝關(guān)鍵酶，占可溶蛋白的30%以上 B、名稱和拷貝數(shù)不同 畢赤酵母/假絲酵母 漢森酵母 醇氧化酶 甲醇氧化酶 alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOX AOX1、AOX2 MOX,1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子,AOX1與AOX2 *畢赤酵母和假絲酵母基因組存在二個AOX基因 AOX1、AOX2 *AOX1與AOX2基因97%同源 *AOX1 占主導(dǎo)地位，負(fù)責(zé)AOX 99%

7、以上活性,1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子,甲醇氧化酶啟動子 A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強(qiáng)的真核啟動子 B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動子 AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo) MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo),2、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點,A、表達(dá)水平高（最高水平的系統(tǒng)） B、產(chǎn)物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、酰脂化 C、過糖基化程度比釀酒酵母少（8-15個vs100-150 個甘露糖） D、產(chǎn)物可正確折疊和高效分泌（最高分泌表達(dá)系統(tǒng)） E、可利用簡單無機(jī)鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵，生物量大。 F、實驗室和工業(yè)操作簡單 G、不能滿足結(jié)構(gòu)要求嚴(yán)格的糖基化,3、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)操作原理,宿主株與標(biāo)記基因 甲醇酵母系

8、統(tǒng)的整合事件 胞內(nèi)表達(dá)與分泌表達(dá),甲醇酵母系統(tǒng)宿主,二大宿主系統(tǒng)主要特點,項目 畢赤酵母 漢森酵母,最適溫度 30 37 最適pH值 4.5 4.5 甘油阻遏 是 否 糖基化 部分過度 較正常 高密度發(fā)酵 100g/L 100g/L,甲醇酵母系統(tǒng)宿主,二大宿主系統(tǒng)主要選擇標(biāo)記,宿主 選擇標(biāo)記,畢赤酵母 his4、G418、 Zeocin、Cu+ 漢森酵母 leu2、 his3 、ura3、 G418,甲醇酵母系統(tǒng)宿主,畢赤酵母系統(tǒng)主要宿主株,宿主株 特點,Y11430 野生型、Mut+ GS115 his4- 、Mut+ KM71 his4-、 aox1:ARG4 (AOX1-)、Muts S

9、MD1168 his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌 MC1003 his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生長,甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件,YRp型載體：漢森系統(tǒng) 傳代不穩(wěn)定，傳代過程同源或非同源重組，高選擇壓力迫使高拷貝數(shù)整合，可達(dá)100拷貝。 YIp型載體： A、在靶序列處線性化載體DNA，誘導(dǎo)同源重組 B、有“插入”和“取代”二類整合模式 C、主要為單拷貝整合，1-10%為多拷貝整合,畢赤酵母系統(tǒng)模式表達(dá)載體,1）AOX1位點插入,宿主株:GS115、KM71 可插入位點： 5AOX1 3AOX1 TT,轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts,2）His4位點插入

10、,轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts,宿主株:GS115、KM71 可插入位點： 5His4 3His4,3） 多基因插入事件（串聯(lián)整合,宿主株:GS115、KM71 可插入位點： 5AOX1 3AOX1 TT,轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts,4） 基因取代（GS115，AOX1,轉(zhuǎn)化子：His4+Muts,漢森酵母系統(tǒng)的高拷貝整合型表達(dá)載體,高拷貝整合元件： A、高度重復(fù)序列：rDNA 提供多個整合位點 B、缺陷型標(biāo)記基因：Leu2d 提高選擇壓力 C、抗性標(biāo)記；neo 提高選擇壓力,甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體,表達(dá)載體類型,需要

11、帶入ATG,單位點,甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體,表達(dá)載體類型,需要帶入ATG,多位點,甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體,信號肽：PHO1,甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體,信號肽：MF,甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體,信號肽：MF,標(biāo)記：Kan,4、甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素與對策,載體穩(wěn)定性 基因劑量 整合位點 甲醇利用表型 mRNA5端 AT含量分泌信號 表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性,1）載體穩(wěn)定性,同拷貝數(shù)時，整合型的比自主復(fù)制型的表達(dá)水平高 YRp型載體的穩(wěn)定化： 選擇非選擇培養(yǎng)交替數(shù)十代可得穩(wěn)定的整合子，但費時，整合位點不確定。 采用YIp型載體: 更易實現(xiàn)整合、整合位點清楚,2）基因劑量,外源基因表達(dá)存在基因劑量效應(yīng) 篩選多拷貝整合子 載體引入G418/Zeocin抗性標(biāo)記，整合子拷貝數(shù)與抗性成正相關(guān)，采用高G418/Zeocin抗性轉(zhuǎn)化子。 體外串聯(lián)多個表達(dá)盒，直接獲多拷貝整合子 采用YRp型載體穩(wěn)定化技術(shù)獲高拷貝整合子 構(gòu)建高拷貝整合型表達(dá)載體,3）整合位點,外源基因表達(dá)盒整合于AOX/MOX或標(biāo)記基因處，均可高效表達(dá) 畢赤酵母中個別情況整合于His4位點的比AOX1位點的低,4）甲醇利用表型,在分泌表達(dá)情況下，甲醇慢生長型更利于表達(dá),5）mRNA5端,mRNA5端非翻譯區(qū)（UTR）的組成與長度 應(yīng)盡量與AOX1/MOX的一致 應(yīng)盡量避免在UTR區(qū)出現(xiàn)AUG和次級結(jié)構(gòu),6）基因序列的AT含量 AT