重組體的篩選與鑒定

1、黏性末端連接法是最常用的連接方法，具有許多優(yōu)點，但是也有一些不足，請指出這些不足之處,黏性末端連接法不足之處有： (1)載體易自身環(huán)化； (2)若是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的黏性末端連接又不易定向克隆； (3)難插入特定的基因； (4)再者就是大片段DNA的重組率較低，即使用堿性磷酸酶處理了載體，防止了載體的自身環(huán)化，載體也有成環(huán)的傾向； (5)用這種方法產(chǎn)生的重組體往往含有不止一個外源片段或不止一個載體連接起來的串聯(lián)重組體，增加篩選工作的困難,第六章 重組體克隆的篩選和鑒定,轉(zhuǎn)化子和重組子,轉(zhuǎn)化子：將導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子,重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子成

2、為重組子。 如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆子或期望克隆子,選擇 (selection) 篩選 (screening) 選擇：通過外來附加壓力（或因素）的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆類型的一種方法。 篩選：通過特定的方法，例如核酸雜交以及免疫測定，從被分析的細胞群體或基因文庫中，鑒定出真正是所需重組DNA分子的特定克隆過程 由于被篩選的大量的菌落和噬菌斑當(dāng)中，僅有很少的比例含有期望的重組DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特異的篩選方法,根據(jù)所使用克隆載體的特性不同，重組克隆的篩選方法也多種多樣。比如，用噬菌體DNA作為載體時就不需要篩選，所有正常的噬菌斑都是重組體

3、；當(dāng)使用pUC系列載體時，白色菌落一般都是重組體；如果所用的質(zhì)粒并不具備明顯的鑒別特性，那么我們也可以利用DNA的酶切分析進行直接鑒定。比如，從平板上隨機挑選10個菌落，然后提取其中的質(zhì)粒DNA分子，并對其進行酶切分析，同樣可以準確地選擇得到所要的重組克隆，而且同時可以鑒定外源片段插入的方向，選擇得到所要的理想克隆。 有時，我們不僅想知道哪些是重組體克隆，而且想知道重組體克隆中哪些是含有某個基因的克?。ū热缭赾DNA文庫的篩選中，我們就需要選擇到含有目的基因克?。?。這時我們可以用比較復(fù)雜的核酸雜交或免疫化學(xué)的方法,一、抗藥性標記及其插入失活選擇法,pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因: Te

4、tr和Ampr。 Tetr上有插入位點BamH I和Sal I; Ampr上有插入位點Pst I,第一節(jié) 載體表型選擇法,1. 原理,pBR322,1）四環(huán)素,2）氨芐青霉素抗性基因,2. pBR322抗菌素標記選擇,含bla基因的菌體產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍灰色）褪色,抑制細菌生長，但不殺死細菌,殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌,3）環(huán)絲氨酸,3. 選擇過程,如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆,Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死

5、，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死,1）四環(huán)素抗性插入失活,無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基,2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程,如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇,二、-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法,半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛藍,深藍色,1. 原理,載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。 受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達。 載體和受體菌基因組可以互補形成完整有功能的-半乳糖苷酶,假陽性： 如果

6、插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)或沒有終止密碼；（不破壞肽,2. 選擇過程,半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物,利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物特性進行直接選擇。（只在特定條件下,轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷,一、原理,第二節(jié) 根據(jù)插入基因的表型選擇,1.彌補缺陷,his,his,受體菌,外源基因,在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長,小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧芐二氨嘧啶(抑制大腸桿菌生長)有抗性,DHFR,載體,連接,轉(zhuǎn)化受體菌,三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板,含DHFR的克隆才能生長,例,使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型,2. 增加新性狀,降解,利用有插入片段的重組載體

7、的分子量比野生型載體分子量大,一、直接電泳檢測法,從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量,第三節(jié) DNA電泳檢測法,分子量 Marker,載體,重組克隆,二、酶切電泳篩選法,1. 原理,根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長度,或用合適的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計的結(jié)果,酶切前,酶切后,插入片斷,載體,A,B,A或B,不同克隆的酶切結(jié)果,篩選過程,三、PCR擴增檢測法,1. 原理,PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片斷,2. 過程,1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA,2）用外源

8、DNA插入片斷引物作PCR,3）電泳PCR產(chǎn)物,4）檢查是否有PCR產(chǎn)物,5）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致,1. 核酸雜交,第四節(jié) 核酸雜交檢測法,一、原理,重組克隆與探針雜交,3. 識別標記,32P 或 125I,1）放射性同位素,2. 檢測用的探針,與外源DNA插入片斷互補的序列,2）非放射性標記,熒光素,二、核酸雜交檢測方法,用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品,1. Southern blotting,從宿主細胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交,只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示,酶切前,酶切后,插入片斷,載體,Southern blot 篩選結(jié)

9、果,1）原位雜交篩選,特點,對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落,2）R-環(huán)檢測法,DNA-RNA雜交,1）原理,2）選擇過程,在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見一種R-環(huán)形結(jié)構(gòu),用外源基因的mRNA與重組載體雜交,缺點：需要電鏡,2. Northern blotting,用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品,主要檢測插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄,從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交,利用抗體作為“探針”來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因,根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式,

10、一、放射性抗體檢測法,第五節(jié) 免疫化學(xué)檢測法,1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式,對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白蛋白“雜交,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,125I 標記的二 抗結(jié)合蛋白,固相支持濾膜,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,125I標記的二抗,固相支持濾膜,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,固相支持濾膜,固相支持濾膜,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,125I 標記的二抗 結(jié)合蛋白,125I標記的二抗,2. 放射性抗體檢測法過程,3. Broome-Gilbert雙位點檢測法,質(zhì)?；駻,插入基因B,表達,質(zhì)粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,檢測融合蛋白,既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物,固相支 持濾膜,抗A抗體

11、,125I標記的 抗B抗體,質(zhì)粒蛋白A,外源蛋白B,質(zhì)粒蛋白A,外源蛋白B,固相支 持濾膜,抗A抗體,發(fā)光，底片曝光,二、免疫沉淀檢測法,把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)校?/b當(dāng)插入基因的表達產(chǎn)物被細菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈,1. 原理,抗原抗體凝集反應(yīng),檢測分泌型產(chǎn)物,2. 方法,對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā),三、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA,Enzyme-linked immunosorbant assay,1. 原理,一抗（primary antibody）: 與目標分子的特異結(jié)合。 二抗（secondary antibody

12、）： 與一抗的特異性結(jié)合。 酶連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標分子的含量,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,酶,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,無色的底物,有色的產(chǎn)物,比色觀察,酶,19,2. ELISA檢測的一般步驟,1）固定樣品,將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底,孔底,加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體,2）一抗結(jié)合,一抗,加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗,二抗上聯(lián)著一種酶（堿性

13、磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等,3）二抗結(jié)合,二抗,加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光,4）顯色反應(yīng),在特殊的分光光度儀（酶標儀）上比色，打印出結(jié)果,5）比色,3.ELISA的局限性,有效，但準確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。 必須與其他方法一起綜合考慮,最好用單克隆抗體（monoclonal antibody,臨床檢驗常用的單抗,四、免疫印跡（western blotting）法,1.原理,在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶,1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負電荷

14、,SDS,SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE,Polyacrylamide gel electrophoresis,在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開,電泳buffer,電泳buffer,點樣,電泳方向,蛋白質(zhì)電泳的分子量標準,已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計,商品化供應(yīng),Da,道爾頓(質(zhì)量單位, 等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。 一克約為61023道爾頓,Dalton,SDS PAGE,凝膠中的蛋白質(zhì)染色,考馬斯亮藍： 靈敏度底、只能檢出0.3-

15、1g/帶，但可褪色回收,硝酸銀： 靈敏度高、可檢出2-5ng/帶,2）轉(zhuǎn)到膜上進行染色,1）直接染色,直接染色電泳結(jié)果,2）Western blotting,電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等,Western（轉(zhuǎn)膜,膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上,膜,膠,蛋白,Western裝置,Blotting,原理與ELISA相同,待測蛋白,硝酸纖 維素膜,一抗,二抗,辣根過氧 化物酶,底物,產(chǎn)物， 并發(fā)出光,PAGE膠,待測蛋白,底片曝光,辣根過氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結(jié)合,2）洗去未結(jié)

16、合的一抗,3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO,4）清洗掉未結(jié)合的二抗,5）用HRPO的底物浸泡膜,6）暗室里曝光，沖洗膠片,Blotting過程,Immuno Blotting,結(jié)果,多克隆抗體Blotting的結(jié)果,單抗blotting結(jié)果,一、無細胞翻譯系統(tǒng),第六節(jié) 轉(zhuǎn)譯篩選法,能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細胞提取物。 如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細胞提取物系統(tǒng),借助無細胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期,適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因,二、轉(zhuǎn)譯篩選,mRNA,無細胞翻譯系統(tǒng),35S標記的 甲硫氨酸,翻譯,35S標記的肽鏈,P

17、AGE電泳,放射自顯影,比較放射性 帶紋的位置,載體+外源DNA,轉(zhuǎn)錄,與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符,三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法,mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制,單鏈mRNA,核糖體 小亞基,核糖體 大亞基,能翻譯,mRNA,DNA,核糖體 小亞基,核糖體 大亞基,不能翻譯,1. 原理,2. 過程,四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法,1. 原理,在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對應(yīng)的mRNA，進行體外轉(zhuǎn)錄。 研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等,2. 過程,硝酸纖 維素濾膜,載體和插 入的cDNA

18、,總mRNA,cDNA基因的 mRNA,雜交,洗脫,cDNA基因的 mRNA,體外翻譯,cDNA編碼的蛋白,電泳,凝膠放射自顯影,cDNA編 碼的蛋白,硝酸纖 維素濾膜,載體和插 入的cDNA,硝酸纖 維素濾膜,載體和插 入的cDNA,收集,35S標記的氨基酸,專門設(shè)計檢測能同DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子,待測蛋白質(zhì),硝 酸 纖 維 素 濾 膜,能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的DNA序列,放射性標記,待測蛋白質(zhì),硝 酸 纖 維 素 濾 膜,能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的DNA序列,放射性標記,五、DNA-蛋白質(zhì)相互作用篩選法,一般克隆與篩選策略,第七節(jié) 幾種常用的真核生物重組基因選擇方法,真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸

19、提供甲基,二氫葉酸,四氫葉酸,二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR,一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標記,1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk,1）TK選擇原理,四氫葉酸的必要性,DHFR,氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用,氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。 能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成,胸苷酸激酶的補救作用,TK+細胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成TTP，存活,T,tk,次黃嘌呤的補救作用,細胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP,HAT培養(yǎng)基,Tk- 細胞株,T

20、K基因,宿主細胞,載體標記,2）TK選擇過程,含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine,只有轉(zhuǎn)入TK基因的細胞才能生存,20,真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基,2. 二氫葉酸還原酶基因（DHFR,1） 選擇原理,二氫葉酸還原酶的必要性,dUMP,dATP,TTP,dCTP,四氫葉酸,四氫葉酸,DHFR+細胞,二氫葉酸,四氫葉酸,二氫葉酸還原酶,二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸,DHFR+細胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸,能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存,不需要補救,DHFR- 細胞,DHFR- 細胞不能產(chǎn)生

21、二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸,需要補救,不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存,胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救,dUMP,dATP,TTP,dATP,次黃嘌呤,補救,胸苷,補救,無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時,胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補救,DHFR-細胞株（不能在無核苷酸的培養(yǎng)基中生長,宿主細胞,2）選擇過程,透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補救,無核苷酸的培養(yǎng)基,需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救,氨甲喋呤“加壓,添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補救作用，可提高選擇,DHFR+基因,載體標記,只有轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細胞才能生存,DHFR,DHFR,DHFR,DHFR,live,die

22、,無核苷酸的培養(yǎng)基,是細菌抗生素，干擾細菌的核糖體，使細菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進行，但不影響真核生物,3. 新霉素抗性基因（neor,1）選擇原理,新霉素（neomycin,新霉素的類似物，是一種 氨基糖苷，對真核細胞和原核細胞都有毒性,G418（geneticin,新霉素抗性基因-neor,細菌的新霉素抗性基因（neor）編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH），能使G418失活,G418,真核細胞,死亡,G418,存活,neor,真核細胞,含致死劑量G418的完全培養(yǎng)基,G418培養(yǎng)基,真核細胞株均可,neor基因,宿主細胞,載體標記,2）選擇過程,G418：（100-800g/mL,CAT是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn