生物化學生物信息的傳遞上從DNA到RNA

1、第三章 生物信息的傳遞（上）從DNA到RNA,3.1 RNA的轉(zhuǎn)錄 3.2 啟動子與轉(zhuǎn)錄起始 3.3 原核生物與真核生物mRNA的特征比較 3.4 終止與抗終止 3.5 內(nèi)含子的剪接、編輯及化學修飾,DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復制得到永存，并通過轉(zhuǎn)錄生成信使RNA、翻譯生成蛋白質(zhì)的過程來控制生命現(xiàn)象,轉(zhuǎn)錄(transcription,基因表達,翻譯(translation,拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同(U替換T)的RNA單鏈的過程，是基因表達的核心步驟,以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過程，是基因表達的最終目的,轉(zhuǎn) 錄,翻 譯,AT

2、GC,RNA分子來自DNA。儲存于DNA雙鏈中的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄酶促反應按照堿基互補配對的原則被轉(zhuǎn)化成為單鏈RNA分子。 生物體內(nèi)共有3種,信使RNA(messenger RNA，mRNA,轉(zhuǎn)移RNA(transfer RNA，tRNA,核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA,轉(zhuǎn)錄(transcription):是指以DNA為模板，在依賴于DNA的 RNA聚和酶催化下，以4中rNTP（ATP、 CTP、GTP和UTP）為原料，合成RNA 的過程,轉(zhuǎn)錄 ( transcription ) 生物體以DNA為模板合成RNA的過程,轉(zhuǎn)錄,在有些病毒中，RNA也可以指導合成RNA,是基因表達

3、的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。 以Double Strand DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄模板 (雜交實驗所證實,T C G A G T A C,A G C T C A T G,C G A G U A C,G C A U,RNA聚合酶,有意義鏈,反意義鏈,RNA,PPi,5,5,3,GTP,UTP,CTP,ATP,UTP,RNA在DNA模板上的生物合成,3,3,5,轉(zhuǎn) 錄 過 程,有義鏈 (sense strand) 又稱編碼鏈 coding strand: 指不作模板的DNA單鏈,反義鏈 (antisense strand) 又稱模板鏈 template srand : 指作為模板進行RNA轉(zhuǎn)錄

4、的鏈,60年代以前的表示方法與此相反) 沒有 AU GC 的規(guī)律,在依賴DNA的RNA聚合酶作用下進行轉(zhuǎn)錄 AU、CG 合成RNA分子 轉(zhuǎn)錄合成RNA鏈的方向為53，模板單鏈DNA的極性 方向為35， 而非模板單鏈的極性方向與RNA鏈相 同，均為53。（書寫） 基因轉(zhuǎn)錄方式為不對稱轉(zhuǎn)錄(一條單鏈DNA 為模板,RNA 聚合酶的結(jié)合,參 與 轉(zhuǎn) 錄 的 物 質(zhì),原料 : 4種NTP ( ATP, UTP, GTP, CTP ) 模板 : DNA 酶 : RNA聚合酶 其他蛋白質(zhì)因子,不對稱轉(zhuǎn)錄 兩層含義：（1）在DNA雙鏈分子上，僅一股鏈可轉(zhuǎn)錄 （2）模板鏈非永遠在同一條單鏈上,模 板,為結(jié)構(gòu)基

5、因 （有義鏈、編碼連,為反義鏈（模板鏈,不對稱轉(zhuǎn)錄,3,3,5,5,箭頭表示轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物生成方向,3.1 RNA的轉(zhuǎn)錄,3.1.1 轉(zhuǎn)錄的基本過程 無論是原核還是真核細胞，轉(zhuǎn)錄的基本過程都包括:模板識別、轉(zhuǎn)錄起始、通過啟動子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止,RNA 的轉(zhuǎn)錄包括 promotion. elongation. terminaton 三過程 從啟動子 (promoter)到終止子(terminator)稱為轉(zhuǎn)錄單 位 (transcription unit) (轉(zhuǎn)錄起始點) 原核生物的轉(zhuǎn)錄單位多為 polycistron in operon,真 核生物中的 轉(zhuǎn)錄單位多為monocistron, No

6、operon 轉(zhuǎn)錄起點即轉(zhuǎn)錄原點記為1，其上游記為負值，下游 記為正值,轉(zhuǎn)錄起始點,兩個相關(guān)概念: 操縱元(operon): 是原核生物基因 表達調(diào)控的一個 完整單元，其中 包括結(jié)構(gòu)基因、 調(diào)節(jié)基因、操縱 子和啟動子,酶與模板的辯認結(jié)合 1、轉(zhuǎn)錄起始點開始轉(zhuǎn)錄的位點，常標以 +1 2、結(jié)合部位約為7個堿基長度，其中心位于上 游- 10 bp處被稱為 10區(qū)或 Pribnow 盒(TATA盒）。該 區(qū)具高度保守性，并易解鏈。 3、識別部位RNA聚合酶亞基識別的部位，約 含6個堿基長度，其中心位于上游 - 35 bp處被稱為 35 區(qū),啟動序列(原核,啟動子（真核） 順式作用元件,TGTTGACA

7、,TATAAT,3 5,5 3,DNA,編碼鏈 模板鏈,35 區(qū),10 區(qū),1,5 McGPPP,轉(zhuǎn)錄起始部位,啟動子,基因轉(zhuǎn)錄區(qū),RNA產(chǎn)物,NH2,翻譯開始,轉(zhuǎn)錄開始,基本過程 1、轉(zhuǎn)錄起始 原核生物需要依賴 因子辨認轉(zhuǎn)錄起始點， 被辨認的DNA區(qū)段處-35區(qū)特定序列。 真核生物轉(zhuǎn)錄起始也需要RNApol對起始區(qū) 上游DNA序列做辨認和結(jié)合，并生成起始復合物， 但其上游DNA序列（統(tǒng)稱為順式作用元件）不象 原核生物那樣典型,2、延長 在RNA聚合酶催化下，按 53 方向合成 5，3-磷酸二酯鍵。酶-DNA-RNA形成轉(zhuǎn)錄復合物。 3、終止 原核生物有兩種機制： （1）依賴 因子（Rho f

8、actor）的轉(zhuǎn)錄終止可識別來自RNA產(chǎn)物的終止信號，而不是來自DNA摸板。 （2）非依賴 因子的轉(zhuǎn)錄終止終止子特點是RNA產(chǎn)物具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)（莖-環(huán)結(jié)構(gòu)）和一段富含polyU片段。 真核生物的轉(zhuǎn)錄終止是與轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān)的,啟動子(promoter,指DNA分子上被RNA聚合酶識別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復合物的區(qū)域 ，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點(頻率、效率,模板識別階段主要指RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程,轉(zhuǎn)錄起始前，啟動子附近的DNA雙鍵分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對。轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個核苷酸鍵的產(chǎn)生,在原核生物中,通過啟動

9、子階段,轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈,此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并導致轉(zhuǎn)錄重新開始。一旦RNA聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進人正常的延伸階段,所以，通過啟動子的時間代表一個啟動子的強弱。一般說來，通過啟動子的時間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高,轉(zhuǎn)錄的延伸,RNA聚合酶離開啟動子，沿DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程,在37時，大腸桿菌RNA聚合酶完成該反應的速度為每秒40個核苷酸,RNA鏈的延伸圖解,轉(zhuǎn)錄的終止,當RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點時，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，R

10、NA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來,復 制 轉(zhuǎn) 錄 模板 兩股鏈 模板鏈（反義鏈） 原料 dNTP NTP 配對 A - T , G - C A - U , G - C 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 產(chǎn)物 半保留DNA 三種RNA,轉(zhuǎn)錄與復制的區(qū)別,真核生物RNA聚合酶不能直接識別基因的啟動子區(qū)，需要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(輔助蛋白質(zhì))按特定順序結(jié)合于啟動子上，RNA聚合酶才能與之相結(jié)合并形成復雜的前起始復合物,轉(zhuǎn)錄和翻譯的速度基本相等，37時，轉(zhuǎn)錄生成mRNA的速度每秒鐘合成14個密碼子，而蛋白質(zhì)合成的速度大約是每秒鐘15個氨基

11、酸,3.1.2 轉(zhuǎn)錄機器的主要成分,3.1.2.1 RNA聚合酶,原核和真核生物的RNA在分子組成、種類和生化特性上各有特色,不需要任何引物,RNA或RNA-DNA雙鏈雜合體不能作為模板,一、原核生物的RNA polymerase (E. coli,1、全酶 (Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme,原核生物的RNA聚合酶(DDRP) E. coli的RNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體（ 2,起始因子,RNA聚合酶全酶及核心酶電泳圖譜,1) 全酶（Holo Enzyme） 用于轉(zhuǎn)錄的起始 依靠空間結(jié)構(gòu)與DNA模板結(jié)合 (與核心酶結(jié)合后 引起的構(gòu)象變化) 專一性地與DNA序列

12、(啟動子)結(jié)合 結(jié)合常數(shù)：1014mol 半衰期：數(shù)小時 （107mol 1秒以下） 轉(zhuǎn)錄效率低，速度緩慢（ 的結(jié)合,2） 核心酶 （Core Enzyme） 作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過程（終止） 依靠靜電引力與DNA模板結(jié)合（蛋白質(zhì)中堿性 基團與DNA的磷酸根之 間） 非專一性的結(jié)合（與DNA的序列無關(guān)） 結(jié)合常數(shù)：1011mol 半衰期：60秒,此外，新發(fā)現(xiàn)的一種亞基的功能尚不清楚。 2、各亞基的特點和功能 （1） 因子 因子可重復使用 修飾RNApol構(gòu)型 使Holo Enzyme 識別啟動子的Sextama Box(35區(qū)), 并通過與模板鏈結(jié)合,2,2,2,2,3）全酶的組裝過程,不同的因子

13、識別不同的啟動子 E.coli 中有四種因子（70、32、54、28） 枯草桿菌中有11種因子 （因子的更替對轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控） （2）因子,核心酶的組建因子,促使RNApol 與DNA模板鏈結(jié)合,前端因子使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈 尾端因子使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈,3） 因子,完成NMP之間的磷酸酯鍵的連接 Editing 功能（排斥與模板鏈不互補的堿基） 與Rho （）因子競爭RNA 3end,E site（elongation site RifR）:對NTP非專一性地結(jié) 合（催化作用和Editing功能,4） 因子 參與RNA非模板鏈（sense strand）的結(jié)合 （充當SSB

14、,構(gòu)成Holoenzyme 后，因子含有兩個位點 I site（initiation site . Rifs）: 該位點專一性地結(jié)合 ATP或者GTP （需要高濃度的ATP或GTP,由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個功能位點,有義DNA鏈結(jié)合位點（ 亞基提供） DNA/RNA雜交鏈結(jié)合位點（亞基提供） 雙鏈DNA解鏈位點（前端 亞基提供） 單鏈DNA重旋位點（后端亞基提供） 因子作用位點,E. coli RNA polymerase,用于起始和延伸,只用于起始,36.5 KD,36.5 KD,151 KD,155 KD,11 KD,70 KD,每個細胞中約有7000個RNA聚合酶分子,每一時

15、刻有20005000個酶在執(zhí)行轉(zhuǎn)錄DNA模板的功能,因子大大增加聚合酶對啟動子的親和力，并降低酶對非專一位點的親和力，使酶專一性識別模板上的啟動子,當新生RNA鏈達到69個核苷酸時，能形成穩(wěn)定的酶DNARNA三元復合物，并釋放因子，轉(zhuǎn)錄進人延伸期,當聚合酶按5 3方向延伸RNA鏈時，解旋的DNA區(qū)域也隨之移動。 聚合酶可以橫跨約40個堿基對，而解旋的DNA區(qū)域大約是17個堿基對。 自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA鏈上，并形成DNA-RNA雜合體。 隨著聚合酶在模板上的運動，靠近3端的DNA不斷解旋，同時在5端重新形成DNA雙鏈，將RNA鏈擠出DNA-RNA雜合體。 RNA的3端大約有203

16、0個核苷酸與DNA和聚合酶相結(jié)合,RNA合成過程,起始,雙鏈DNA局部解開,磷酸二酯鍵形成,終止階段,解鏈區(qū)到達基因終點,延長階段,RNA,啟動子（promotor,終止子(terminator,二、真核生物的RNApol 1、 三種RNApol： 根據(jù)對 - 鵝膏蕈堿的敏感性不同而分類 RNApol 最不敏感 （動、植、昆） RNApol 最敏感 RNApol 不同種類的敏感性不同 2、 位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNApol 核仁 活性所占比例最大 轉(zhuǎn)錄rRNA（5.8S、18S、 28S,RNApol 核質(zhì) 主要負責 hnRNA、snRNA 的轉(zhuǎn)錄 hnRNA（mRNA 前體，核不均一RNA he

17、terogeneous nuclear RNA） snRNA（核內(nèi)小分子 RNA small nulear RNA) RNApol 核質(zhì) 負責 tRNA、5S rRNA、Alu序列和 部分 snRNA 目前在線粒體和葉綠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)少數(shù) RNApol（活性較低,真核生物線粒體和葉綠體中還存在著不同的RNA聚合酶,線粒體RNA聚合酶只有一條多肽鏈，相對分子質(zhì)量小于7x104，是已知最小的RNA聚合酶之一，與T7噬菌體RNA聚合酶有同源性,葉綠體RNA聚合酶比較大，結(jié)構(gòu)上與細菌中的聚合酶相似，由多個亞基組成，部分亞基由葉綠體基因組編碼,3、亞基組成： 分子量500KDa,含兩個大亞基和 712 個小亞

18、基 RNApol： 大亞基中有 C 末端結(jié)構(gòu)域 (carboxy terminal domain CTD) CTD中含一保守氨基酸序列的多個重復 TyrSerProThrSerProSer C 端重復七肽 不同生物中重復數(shù)目不一樣（酶活性,CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol 被稱為A 非磷酸化的 RNApol 稱為B CTD參與轉(zhuǎn)錄 B A 使 RNApol易于離開 啟動子進入延伸過程（10倍,真核生物中共有3類RNA聚合酶，它們在細胞核中的位置不同，負責轉(zhuǎn)錄的基因不同。 真核生物RNA聚合酶一般有814個亞基所組成，相對分子質(zhì)量超過5105,聚合酶中有兩個相對

19、分子質(zhì)量超過l105的大亞基,同種生物3類聚合酶有共享小亞基的傾向，即有幾個小亞基是其中3類或2類聚合酶所共有的,3類聚合酶的亞基種類和大小存在兩條普遍遵循的原則,3.1.2.2 轉(zhuǎn)錄復合物,啟動子選擇階段,RNA聚合酶全酶對啟動子的識別,聚合酶與啟動子可逆性結(jié)合形成封閉復合物（closed complex,伴隨著DNA構(gòu)象上的重大變化，封閉復合物轉(zhuǎn)變成開放復合物(open complex,開放復合物與最初的兩個NTP相結(jié)合并在這兩個核苷酸之間形成磷酸二酯鍵后(RNA聚合酶、DNA和新生RNA)三元復合物,強啟動子,封閉復合物 開放復合物（不可逆的快反應,真核生物轉(zhuǎn)錄起始復合物的分子量很大：R

20、NA聚合酶、7種輔助因子（包含多個亞基,三元復合物可以進入兩條不同的反應途徑,一是合成并釋放29個核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物流產(chǎn)式起始,二是盡快釋放亞基，轉(zhuǎn)錄起始復合物通過上游啟動子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復合物,轉(zhuǎn)錄的真實性取決于,有特異的轉(zhuǎn)錄起始位點,轉(zhuǎn)錄起始后按照堿基互補原則準確地轉(zhuǎn)錄,模板DNA序列及具有特異的終止部位,因子,只有帶因子的全酶才能專一地與DNA上的啟動子結(jié)合，選擇其中一條鏈作為模板，合成均一的產(chǎn)物。因子的作用只是起始而已，一旦轉(zhuǎn)錄開始，它就脫離了起始復合物，而由核心酶負責RNA鏈的延伸,因此，聚合酶全酶的作用是啟動子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的

21、作用是鏈的延伸,終止信號,較穩(wěn)定,3.2 啟動子與轉(zhuǎn)錄起始,大腸桿菌RNA聚合酶與啟動子的相互作用主要包括,3.2.1 啟動子（promoter）的結(jié)構(gòu)與功能 （Prok.E.coli） 1、啟動子由兩個部分組成 （1） 上游部分 CAP-cAMP結(jié)合位點 （基因表達調(diào)控的正控制位點） CAP（catabolite gene Activator Protein） 降解物基因活化蛋白，環(huán)腺苷酸（cAMP）的受體蛋白 （2） 下游部分 RNApol的進入（結(jié)合）位點 35 10 包括識別位點和結(jié)合位點（R B位點,2、 RNA聚合酶的進入位點 （1） Sextama 框（Sextama Box）

22、-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）結(jié)合位點， RNA聚合酶依靠其亞基識別該位點 識別位點（R位點） 大多數(shù)啟動子中共有序列為 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上決定了啟動子的強度 （RNApol 的因子） 位置在不同啟動子中略有變動,2） Pribonow 框（Pribonow Box） -10序列，RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點 結(jié)合位點（B 位點） 一致序列：T80A95T45A60A50T96 （TATPUAT,位置范圍 4 到13,因此又稱TATA Box,啟動子的研究： (RNA聚合酶保護法,保守序列 （一致性序列,RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合,3） 起始

23、位點（initiation site）：1位點 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點 起始NTP多為ATP或GTP (嘌呤,起始過程 ： a. 全酶與啟動子結(jié)合的封閉型啟動子復合物的形成 （ R位點被因子發(fā)現(xiàn)并結(jié)合,b、 開放型啟動子復合物的形成 RNApol的一個適合位點到達10序列區(qū)域，誘導富 含A.T的Pribnow 框的“熔解”， 形成1217bp的泡狀 物，同時酶分子向10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合 開放型啟動子復合物使RNApol聚合酶定向 兩種復合物均為二元復合物（全酶和DNA,1217bp,c. 在開放型的啟動子復合物中，RNApol的I位點和E位點的 核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（ 亞

24、基） 三元復合物形成 +1位多為CAT模式,位于離開保守T 69 個核苷酸處,4） 因子解離 核心酶與DNA的親和力下降 起始過程結(jié)束核心酶移動進入延伸過程,轉(zhuǎn)錄的起始過程,核心酶,1217bp,CAP-cAMP 結(jié)合位點 （也稱CAP位點） 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，I 阻遏蛋白 負調(diào)控 lac 操縱子模型,I,許多基因的表達還存在正調(diào)控機制 例如: E.coli 培養(yǎng)基中乳糖和葡萄糖共存時 只有葡萄糖被 利用 原因：CAP位點的正調(diào)控 葡萄糖缺少時 ，腺苷酸環(huán)化酶將ATP cAMP， cAMP與CAP位點結(jié)合,此時啟動子的進入位點才能 與RNApol結(jié)合 葡萄糖存在時，cAMP不能形成，沒有CAPcAM

25、P 與CAP位點結(jié)合，啟動子的RNApol進入位點不能結(jié) 合RNApol,因此,一個操縱元中有兩道控制開關(guān),只有同時打開,結(jié)構(gòu)基因才 能進行轉(zhuǎn)錄。 （對 lac操縱元而言，只有沒有葡萄糖，有乳糖時才能進行錄） （1）CAP位點的組成 （70 40） 位點：70 50 包括一個IR 序列 強結(jié)合位點 位點：50 40 弱結(jié)合位點 位點對位點具有協(xié)同效應（cooperativity,2） 位點結(jié)合CAPcAMP復合物后，促使RNApol進入 Sextama Box,最終與10序列結(jié)合起始轉(zhuǎn)錄 原因：CAPcAMP復合物與位點結(jié)合 Sextama Box 富含G.C區(qū)域（G.C島區(qū)）穩(wěn)定性降低 Pr

26、ibnow Box 的溶解溫度降低 促進開放型啟 動子復合物的形成 促進轉(zhuǎn)錄,4、RNApol 在DNA上結(jié)合位點的鑒定 DNase 法-40bp 而足跡法（footprinting）結(jié)果相對準確 足跡法原理： 限制酶切割結(jié)合有RNApol的DNA 大分子DNA 末端標記該DNA（Klenow片段標記3,堿性磷酸酯 酶標記5） 用內(nèi)切酶降解DNA（控制反應條件） 凝膠電泳分離，放射自顯影觀察,大片段DNA,末端標記大分子DNA,重新結(jié)合RNApol,作對照 直接用DNase 進行降解,電泳,用微量DNase降解,電泳,用足跡法鑒定出來的 RNApol 與DNA的結(jié)合區(qū)域為 +20 50（40）

27、，大約 60 70 bp 實驗中還發(fā)現(xiàn),實驗中還發(fā)現(xiàn)DNA的兩條鏈受 RNApol 的保護程度不同，說明RNApol與兩條鏈的結(jié)合是不對稱的，表明轉(zhuǎn)錄只需要一條模板，即單鏈轉(zhuǎn)錄,RNA聚合酶保護法,開始轉(zhuǎn)錄,T T G A C A A A C T G T,35 區(qū),T A T A A T Pu A T A T T A Py,10 區(qū),原核生物啟動子保守序列,原核生物啟動子 35區(qū)：一致性序列為TTGACA 是RNA-pol的辨認位點 10區(qū)：一致性序列為TATAAT 又叫Pribnow盒 是RNA-pol的結(jié)合位點,真核生物啟動子,5、 啟動子各位點與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 （1）35 序列與10 序

28、列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 標準啟動子 35 TTGACA 10 TATAAT,不同的啟動子 a. 與標準啟動子序列同源性越高 啟動強度越大,b. 與標準啟動子同源性越低 啟動強度越小 c. 與標準啟動子差異很大時 由另一種因子啟動,原因,35序列通過被 因子識別的容易 決定啟動子強度 10序列影響開放型啟動子復合物形成的速度 決定啟動子強度,啟動子上升突變、啟動子下降突變,2） 35序列與10序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 堿基序列并不重要 間距非常重要，17bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高 間距上的突變種類： 間距趨向于17bp 上升突變 間距遠離17bp 下降突變,E.Coli各識別的啟動子的序列,由含70

29、RNA多聚酶全酶識別的典型大腸桿菌啟動子,3.2.2 啟動子區(qū)的識別,在啟動子區(qū)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶上的某些基團是氫鍵供體，而4種堿基中的某些基團是氫鍵受體。由于它們分別處于DNA雙螺旋的大溝或小溝內(nèi)，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有處于特定空間構(gòu)象的氫鍵受體與供體，當它們與啟動子中對應的分子在一定距離內(nèi)互補時，就形成氫鍵，相互結(jié)合,RNA聚合酶不直接識別堿基對本身，是通過氫鍵互補的方式識別啟動子的,3.2.3 酶與啟動子區(qū)的結(jié)合,在RNA聚合酶與啟動子相互作用的過程中，聚合酶首先與啟動子區(qū)閉合雙鏈DNA相結(jié)合，形成二元閉合復合物，然后經(jīng)過解鏈得到二元開鏈復合物。解鏈

30、區(qū)一般在-9+13之間，而酶與啟動子結(jié)合的主要區(qū)域在其上游,一旦開鏈區(qū)解鏈，酶分子能以正確的取向與解鏈后的有關(guān)單鏈相互作用，形成開鏈復合物。因此，RNA聚合酶既是雙鏈DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。DNA開鏈是按照DNA模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件,3.2.4 -10區(qū)和-35區(qū)的最佳間距,在原核生物中，-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離大約是1619bp,保持啟動子這二段序列以及它們之間的距離都是重要的，否則就會改變它所控制基因的表達水平,小于 15 bp 或大于 20 bp 都會降低啟動子的活性,因為增減bp ，-35區(qū)相對于-10區(qū)旋轉(zhuǎn)（增減一個bp會使兩者之間的夾角發(fā)生36的

31、變化）所產(chǎn)生的超螺旋會發(fā)生改變。若要使酶與DNA在這個區(qū)域內(nèi)保持正確的取向，就必須使二者之一發(fā)生扭曲，需要增加結(jié)合自由能,如果把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平,增加Pribnow區(qū)共同序列的同一性。例如，在乳糖操縱子的啟動子中，將其Pribnow區(qū)從TATGTT變成TATATT，就會提高啟動子的效率，提高乳糖操縱子基因的轉(zhuǎn)錄水平,3.2.5 增強子及其功能,增強子的發(fā)現(xiàn)從SV40開始，在SV40的轉(zhuǎn)錄單元上發(fā)現(xiàn)它的轉(zhuǎn)錄起始位點上游約200bp處有兩段72bp長的重復序列，它們不是啟動子的一部分，但能增強或促進轉(zhuǎn)錄的起始，除去這兩段序列會.若保留其

32、中一段或?qū)⒅〕霾逯罝NA分子的任何部位，就能,這種能強化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強子或強化子(enhancer)。后來在許多基因的啟動區(qū)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了增強子的存在,把-珠蛋白基因置于帶有上述72bp序列的DNA分子上，發(fā)現(xiàn)它在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平提高了200倍。而且，無論把這段72bp序列放在轉(zhuǎn)錄起點上游1400bp或下游3300bp處，它都有轉(zhuǎn)錄增強作用。增強子通過影響染色質(zhì)DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并改變超螺旋而改變模板的整體結(jié)構(gòu)，使得RNA聚合酶更容易與模板DNA相結(jié)合，起動基因轉(zhuǎn)錄,3.2.6 真核生物啟動子對轉(zhuǎn)錄的影響,啟動子是確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的DNA序列。 1979年，美國科學家Goldber

33、g首先注意到真核生物中，由RNA聚合酶II催化轉(zhuǎn)錄的DNA序列5上游區(qū)有一段與原核生物Pribnow區(qū)相似的富含TA的保守序列。由于該序列前4個堿基為TATA，所以又稱為TATA區(qū)(TATA box,此后10多年間，科學家通過對許多基因啟動子區(qū)的分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)功能蛋白基因的啟動子都具有共同的結(jié)構(gòu)模式。簡單地說，真核基因的啟動子在-25-35區(qū)含有TATA序列，在-70-80區(qū)含有CCAAT序列(CAAT box)，在-80-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列(GC box)。TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動子元件(upstream promoter element，UPE

34、)或稱上游激活序列(upstream activating sequence，UAS,原核和真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游區(qū)的結(jié)構(gòu)存在很大的差別,原核基因啟動區(qū)范圍較小，TATAAT (Pribnow區(qū))的中心位于-10，上游只有TTGACA區(qū)(-35區(qū))作為RNA聚合酶的主要結(jié)合位點，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控;真核基因的調(diào)控區(qū)較大，TATA A/TA區(qū)位于-20-30，而-40-110區(qū)為上游激活區(qū),真核基因除了含有可與原核基因啟動子相對應的CAAT區(qū)（7078區(qū)）之外，大多數(shù)基因還擁有GC區(qū)和增強子區(qū),TATA區(qū)和其他兩個UPE區(qū)的作用有所不同,主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始，如果除去TATA區(qū)或進行堿基突變，

35、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物下降的相對值不如CAAT區(qū)或GC區(qū)突變后明顯，但發(fā)現(xiàn)所獲得的RNA產(chǎn)物起始點不固定,CAAT區(qū)或GC區(qū)是決定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)率高低的,CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點的確定。 CAAT區(qū)對轉(zhuǎn)錄起始頻率的影響最大，該區(qū)任一堿基的改變都將極大地影響靶基因的轉(zhuǎn)錄強度，而啟動區(qū)其他序列中一兩個堿基的置換則沒有太大的影響。 在TATA區(qū)和相鄰的UPE區(qū)之間插入核苷酸也會使轉(zhuǎn)錄減弱,盡管這3種啟動子區(qū)序列都有著重要功能，但并不是每個基因的啟動子區(qū)都包含這3種序列。 有些基因，如SV40的早期基因，缺少TATA和CAAT區(qū)，只有6個串聯(lián)在上游-40-110位點的GC區(qū);有些基因，

36、如組蛋白H2B，不含GC區(qū)，但有兩個CAAT區(qū)，一個TATA區(qū),真核細胞中存在著大量特異性或組成型表達的、能夠與不同基因啟動子區(qū)UPE相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子?；蜣D(zhuǎn)錄實際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果,一、真核生物的RNApol 1、 三種RNApol： 根據(jù)對 - 鵝膏蕈堿的敏感性不同而分類 RNApol 最不敏感 （動、植、昆） RNApol 最敏感 RNApol 不同種類的敏感性不同 2、 位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNApol 核仁 活性所占比例最大 轉(zhuǎn)錄rRNA（5.8S、18S、 28S,RNApol 核質(zhì) 主要負責 hnRNA、snRNA 的轉(zhuǎn)錄 hnRN

37、A（mRNA 前體，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA） snRNA（核內(nèi)小分子 RNA small nulear RNA) RNApol 核質(zhì) 負責 tRNA、5S rRNA、Alu序列和 部分 snRNA 目前在線粒體和葉綠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)少數(shù) RNApol（活性較低,3、亞基組成： 分子量500KDa,含兩個大亞基和 712 個小亞基 RNApol： 大亞基中有 C 末端結(jié)構(gòu)域 (carboxy terminal domain CTD) CTD中含一保守氨基酸序列的多個重復 TyrSerProThrSerProSer C 端重復七肽 不同生物中重復數(shù)目不一樣（酶活

38、性,CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 磷酸化的 RNApol 被稱為A 非磷酸化的 RNApol 稱為B CTD參與轉(zhuǎn)錄 B A 使 RNApol易于離開 啟動子進入延伸過程（10倍） 二、 真核生物的啟動子 三種 RNApol 三種轉(zhuǎn)錄方式 三種啟動子 三類基因，類 類 類,1、 RNApol的啟動子 結(jié)構(gòu)最復雜 位于轉(zhuǎn)錄起始點的上游,有多個短序列元件組成 通用型啟動子（無組織特異性） （1） 帽子位點（cap site）：轉(zhuǎn)錄起始位點 與Prok.的“CAT模式”相似 （2） TATA框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框） 位于30處 一致序列為T82A

39、97T93A85A63（T37）A83A50（T37,定位轉(zhuǎn)錄起始點的功能 （類似原核的Pribnow框） TATA是絕大多數(shù)真核基因的正確表達所必需的 （3） CAAT框（CAAT box） 位于75bp處,一致序列為GGC/TCAATCT 前兩個 G 的作用十分重要(轉(zhuǎn)錄效率) 增強啟動子的效率、頻率，不影響啟動子的特異性 （距轉(zhuǎn)錄起始點的距離，正反方向） 以上三個保守序列在絕大多數(shù)啟動子中都存在,4） 增強子（enhancer） （又稱遠上游序列 far upstream sequence） 在100以上 SV40的兩個正向重復研究得最清楚（DR） -107178 、179 250 各

40、72bp 該增強子的特點如下： 對依賴于TATA框的轉(zhuǎn)錄的增強效應高于不依賴 的情況,距離效應: 離72bp越近的容易起始轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄方向離開72bp的起始序列優(yōu)先轉(zhuǎn)錄 細胞類型的選擇：不同類型中作用有差異 表明其作用具有細胞或組織特異性（調(diào)節(jié)蛋白） （5） GC框 （GC box） 位于90附近，較常見的成分 核心序列為GGGCGG 可有多個拷貝，也可以正反兩方向排列,6）其他元件 八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件） 一致序列為 ATTTGCAT KB元件 一致序列為 GGGACTTTCC ATF元件 一致序列為 GTGACGT 還有一些位于起始點下游的相關(guān)元件 （7

41、） 不同元件的組合情況 不同元件的數(shù)目、位置、和排列方向均有差異 例如：SV40的早期啟動子中有6個GC框,小結(jié)： 不同啟動子中每種元件與轉(zhuǎn)錄起始點的距離不同 不同啟動子中的相應元件互相交換,形成的雜交 啟動子功能沒有變化 各種元件將相應的蛋白因子結(jié)合到啟動子上， 組成起始復合物，蛋白因子間的相互作用決定 了轉(zhuǎn)錄的起始,2、 RNApol 啟動子結(jié)構(gòu) （1） 分為三類，每種識別方式不同 a、 下游啟動子（內(nèi)部啟動子） 位于轉(zhuǎn)錄起始點的下游 5SRNA 和 tRNA基因 可分為兩類 b、 上游啟動子 snRNA,2）內(nèi)部啟動子的發(fā)現(xiàn) 最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的5S rRNA基因 試驗設(shè)置： 非洲爪蟾的

42、卵母細胞提取液作為體外轉(zhuǎn)錄體系， 進行缺失試驗 以不同長度的5S rRNA基因為模板進行轉(zhuǎn)錄 結(jié)果： 缺失55以前和缺失80以后的序列都能正常轉(zhuǎn)錄 缺失55到80序列不能轉(zhuǎn)錄,結(jié)論： 5S rRNA基因的啟動子位于基因內(nèi)部 該啟動子可使RNApol在其上游的55bp處起始轉(zhuǎn)錄 （3） 內(nèi)部啟動子分為兩類 均含兩個短序列元件，中間由其他序列隔開 第一類： 含A框和C框 （5S rRNA基因） 第二類： 含A框和B框 （tRNA基因、VARNA基因） 間隔序列長短差異很大 其中內(nèi)部啟動子起被 RNApol 識別的作用,三、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程,一）轉(zhuǎn)錄起始,真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化

43、，轉(zhuǎn)錄起始時，RNA-pol不直接結(jié)合模板，其起始過程比原核生物復雜,轉(zhuǎn)錄起始點,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增強子,順式作用元件(cis-acting element,1. 轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段,AATAAA,切離加尾,轉(zhuǎn)錄終止點,修飾點,外顯子,翻譯起始點,內(nèi)含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚體,2. 轉(zhuǎn)錄因子,能直接或間接辨認和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-acting factors,反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，則稱為轉(zhuǎn)錄因子(trans-criptional factors, TF,參與RNA-pol 轉(zhuǎn)錄的TF

44、,3. 轉(zhuǎn)錄起始前復合物 (pre-initiation complex, PIC,真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子,4. 拼板理論(piecing theory,一個真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成有活性和專一性的復合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應的基因,二）轉(zhuǎn)錄延長,真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象,RNA-pol前移處處都遇上核小體,轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小體,轉(zhuǎn)錄延長中的核小體

45、移位,轉(zhuǎn)錄方向,和轉(zhuǎn)錄后修飾密切相關(guān),5 -AAUAAA,5 -AAUAAA,Poly (A,mRNA,三）轉(zhuǎn)錄終止,3.3 原核生物與真核生物 mRNA的特征比較,mRNA在大腸桿菌細胞內(nèi)占總RNA的2%左右(tRNA占16%，而rRNA則占80%以上,直到20世紀70年代初才首次將這一重要物質(zhì)從細胞中分離出來,現(xiàn)已清楚，許多基因的mRNA在體內(nèi)還是相當穩(wěn)定的，半衰期從幾個小時到幾天不等。目前，人們己能從幾乎所有生物體內(nèi)分離純化編碼任何蛋白質(zhì)的mRNA,mRNA在所有細胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過密碼三聯(lián)子翻譯生成蛋白質(zhì)，但其生物合成的具體過程和成熟mRNA的結(jié)構(gòu)在原核和真核細胞內(nèi)是不同的。

46、 真核細胞mRNA最大特點在于它往往以一個較大相對分子質(zhì)量的前體RNA出現(xiàn)在核內(nèi)，只有成熟的、相對分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學修飾的mRNA才能進入細胞質(zhì)參與蛋白質(zhì)的合成,真核細胞mRNA的合成和功能表達發(fā)生在不同的空間和時間范疇內(nèi),原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個細胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時就被引發(fā),一個原核細胞的mRNA(包括病毒)有時可以編碼幾個多肽，而一個真核細胞的mRNA最多只能編碼一個多肽,原核生物常以AUG作為起始密碼子，有時GUG或UUG也作為起始密碼子；真核生物幾乎永遠以AUG作為起始密碼子,3.3.1 原核生物

47、mRNA的特征,細菌基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯是緊密相聯(lián)的，基因轉(zhuǎn)錄一旦開始，核糖體就結(jié)合到新生mRNA鏈的5端，啟動蛋白質(zhì)合成，而此時該mRNA的3端還遠遠沒有轉(zhuǎn)錄完全。在電子顯微鏡下，我們可以看到一連串核糖體緊緊跟在RNA聚合酶后面,1.原核生物mRNA的半衰期短,絕大多數(shù)細菌mRNA的半衰期很短，mRNA的降解緊隨著蛋白質(zhì)翻譯過程發(fā)生。轉(zhuǎn)錄開始1 min后，降解就開始了，當一個mRNA的5端開始降解時，其3端部分仍在合成或被翻譯。mRNA降解的速度大概是轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半,因為基因轉(zhuǎn)錄和多鏈肽延伸的速度基本相同，所以細胞內(nèi)某一基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的多少決定于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始效率，以大腸桿菌色氨酸合

48、成酶基因為例，平均每分鐘約有15次轉(zhuǎn)錄起始，這些mRNA鏈從生成到降解平均被翻譯10次，所以，穩(wěn)定狀態(tài)下細胞中每分鐘生成150個多肽。我們所討論的mRNA的半衰期只是統(tǒng)計學上的平均值,細菌mRNA可以同時編碼不同的蛋白質(zhì)。編碼多個蛋白質(zhì)的mRNA為多順反子mRNA。多順反子mRNA是一組相鄰基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這一組基因被稱為一個操縱子。 單順反子mRNA為只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA,2、許多原核生物mRNA以多順反子的形式存在,所有mRNA都被分成3部分:編碼區(qū)、位于AUG之前的5端上游非編碼區(qū)以及位于終止密碼子之后不翻譯的3端下游非編碼區(qū)。 編碼區(qū)始于起始密碼子AUG，經(jīng)一連串編碼氨基酸的密碼

49、子直至終止密碼子。 對于多順反子mRNA中的第一個順反子來說，一旦mRNA的5端被合成，翻譯起始位點即可與核糖體相結(jié)合，而后面幾個順反子翻譯的起始就會受其上游順反子結(jié)構(gòu)的調(diào)控,情況一,第一個蛋白質(zhì)合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離mRNA模板，第二個蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大亞基與該蛋白起始密碼子相結(jié)合后才可能開始,情況二,前一個多肽翻譯完成以后，核糖體大、小亞基分離，小亞基不離開mRNA模板，而是迅速與游離的大亞基結(jié)合，啟動第二個多肽的合成,在噬菌體RNA中，一個順反子的翻譯有時完全取決于它前面順反子的翻譯，因為噬菌體RNA往往形成復雜的二級結(jié)構(gòu)，只有第一個翻譯起始位點是暴露的

50、，在這個順反子翻譯產(chǎn)生多肽的過程中，核糖體的運動破壞了后續(xù)順反子的二級結(jié)構(gòu)，才使起始位點較容易與核糖體相結(jié)合形成起復合物,3、原核生物mRNA的5無帽子結(jié)構(gòu)，3端無或者只有較短的poly(A)結(jié)構(gòu),AUG上游712個核苷酸處有一段被稱為SD序列的保守區(qū),原核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點,5,3,先導區(qū),AGGAGGU,SD區(qū),一條mRNA鏈編碼幾種功能相關(guān)的蛋白質(zhì),位于mRNA編碼區(qū)上游的一個短片段，由10個堿基組成（5AAACAGGAGG3），稱為SD順序，與30S小亞基中的16S rRNA3端的六堿基順序（3UCCUCC5）順序互補，這意味著核糖體能選擇正確的AUG密碼來起始蛋白質(zhì)的合成,S-D

51、序列,3.3.2 真核生物mRNA的特征,凡是編碼功能蛋白的真核基因都通過RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄,真核基因幾乎都是單順反子，只包含一個蛋白質(zhì)的信息，其長度在幾百到幾千個核苷酸之間,一個完整的基因，不但包括編碼區(qū)(coding region)，還包括不編碼氨基酸的5和3端的特異性序列,基因的分子生物學定義是,產(chǎn)生一條多肽鏈的功能RNA所必需的全部DNA核苷酸序列,真核生物的mRNA(不包括葉綠體和線粒體)5端都是經(jīng)過修飾的，基因轉(zhuǎn)錄一般從A起始，第一個核苷酸保留了5端的三磷酸基團并能通過其3-OH位與下一個核苷酸的5磷酸基團形成二酯鍵，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的起始序列為pppApNpNp,1、真核生物mRNA的

52、5端的帽子,然而，如果在體外用核酸酶處理成熟mRNA;其5端并不產(chǎn)生預期的核苷三磷酸，而產(chǎn)生以5 5三磷酸基團相連的二核苷酸，5終端是一個在mRNA轉(zhuǎn)錄后加上去的甲基化鳥嘌呤,mRNA5端加“G”的反應是由腺苷酸轉(zhuǎn)移酶完成的，這個反應非常迅速，很難測得5自由三磷酸基團的存在。據(jù)測算，在新生mRNA鏈達到50個核苷酸之前，帽子結(jié)構(gòu)就已加到mRNA的第一個核苷酸上了。即mRNA幾乎一誕生就是戴上帽子的。新加上的G與mRNA鏈上所有其他核酸苷方向正好相反，像一頂帽子倒扣在mRNA鏈上,一般認為，帽子結(jié)構(gòu)是GTP和原mRNA5端三磷酸腺苷（或鳥苷）縮合反應的產(chǎn)物,mRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化。第一個

53、甲基出現(xiàn)在所有真核細胞的mRNA中，稱為零號帽子(cap0,第二個核苷酸(原mRNA5第一位)的2-OH位上加另一個甲基。有這個甲基的結(jié)構(gòu)稱為1號帽子(cap1)，真核生物中以這類帽子結(jié)構(gòu)為主,在某些生物細胞內(nèi)，mRNA鏈上的第三個核苷酸的2-OH位也可能被甲基化，被稱為2號帽子（cap2），占有帽mRNA總量的10%15,帽子結(jié)構(gòu)的功能,免遭核酸酶的破壞,容易被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識別,翻譯所必須，甲基化的帽子結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)合成起始信號的一部分,除組蛋白基因外，真核生物mRNA的3末端都有poly(A)序列，其長度因mRNA種類不同而變化，一般為40200個。 poly(A)序列是在轉(zhuǎn)錄后加

54、上去的，是在細胞核中的不均一核RNA階段加上的,2、多數(shù)真核生物mRNA有poly(A)尾巴,真核基因的3末端poly(A)起始位點上游1530bp處有一段保守序列AAUAAA，這對于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準確切割及加poly(A)是必需的。 點突變實驗將AAUAAA的基因序列變?yōu)锳AGAAA，發(fā)現(xiàn)mRNA的剪接加工受阻，沒有功能性mRNA產(chǎn)生,RNA聚合酶是真核細胞核中轉(zhuǎn)錄RNA的酶。 RNA聚合酶在poly(A)起始位點不終止而繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，大部分基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擁有poly(A)位點下游0.52kb核苷酸序列。 加poly(A)時需要由內(nèi)切酶切開mRNA3端的特定部位，然后由poly(A)合成酶催

55、化多聚腺苷酸的反應,poly(A)尾巴的功能,是mRNA由細胞核進入細胞質(zhì)所必需的形式，提高了mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性,廣泛應用于分子克隆。常用寡聚dT片段與mRNA上的poly(A)相配對，作為反轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA鏈的引物,大部分真核mRNA有poly(A)尾巴，細胞中還有1/3沒有poly(A)的mRNA，帶有poly(A)的mRNA稱為poly(A)+，而把沒有poly(A)的mRNA稱為poly(A)。約1/3的poly(A)mRNA編碼了不同形式的組蛋白，其余2/3的poly(A)mRNA帶有與poly(A)+組分相同的遺傳信息,真核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點,m7G-5ppp-

56、N-3 p,AAAAAAA-OH,一條mRNA鏈只能為一種蛋白質(zhì)編碼,3.4 終止和抗終止 終止過程： 酶停止添加底物釋放RNA鏈酶解離 終止反應雜合雙鏈的氫鍵斷裂， 重新形成雙螺旋，酶的解離。 終止子（terminator）：在轉(zhuǎn)錄的過程中，提供轉(zhuǎn)錄終止 信號的RNA序列 真正起終止作用的是RNA序列與啟動子不同 Prok.和Euk. 都具有一種基因表達調(diào)控的手段,一、原核生物的終止子 1、 終止子的種類 （1） 內(nèi)在終止子（不依賴 因子的終止子） 體外實驗中，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止 （2） 依賴因子的終止子 蛋白質(zhì)輔助因子因子存在時，核心酶終止轉(zhuǎn)錄 兩者有共同的結(jié)構(gòu)特征（序列差

57、異,2、不依賴 因子的終止子 結(jié)構(gòu)特征: 一是形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu) 莖. 720 bp的IR序列形成（富含G/C） 環(huán).中間不重復序列形成 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的突變可阻止轉(zhuǎn)錄的終止 二是6 8 個連續(xù)的U串（發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端,5pppG,5 3,35,莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止,1，使RNA聚合酶變構(gòu) 2，使轉(zhuǎn)錄復合物趨于解離， RNA產(chǎn)物釋放,RNA-pol,莖部富含GC,不依賴終止子結(jié)構(gòu),3、依賴 因子的終止子 （1） 結(jié)構(gòu) IR序列中的 GC 對含量較少 發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端沒有固定特征 （2） 靠與的共同作用而實現(xiàn)終止,無連續(xù) U串,G/C含量較少,二、 原核生物轉(zhuǎn)錄的終止 1、不依賴因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 （1） 新生

58、RNA鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成,與RNApol發(fā)生作用,造成高度延宕（典型的有60秒左右,2） RNApol暫停為終止提供了機會 ，6 8個連續(xù)的U 串可能為RNApol與模板的解離提供了信號 RNADNA之間的 rUdA 結(jié)合力較弱,阻止RNA鏈的釋放,于是： RNADNA解離 三元復合體解體 RNApol解離 轉(zhuǎn)錄終止 （3） 真正的終止點不固定，在 U串中的任何一處 （4） IR序列和U串同等重要 IR中的GC對含量的減少 U串的縮短或缺失 （5） DNA上與U串對應的為富含AT的區(qū)域 說明：AT富含區(qū)在轉(zhuǎn)錄的終止和起始中均起重要的作用,2、依賴 因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄 （1） 通讀（read th

59、rough）：在依賴 因子的轉(zhuǎn)錄終止 過程中， RNApol 轉(zhuǎn)錄了 IR 序列之后，雖發(fā)生 一定時間的延宕，但如果沒有 因子存在，則 RNApol 會繼續(xù)轉(zhuǎn)錄 （2） 因子 a、 活性形式為六聚體 促進轉(zhuǎn)錄終止的活性，NTPase 活性,b、 RNA長度大于50nt時，依賴RNA的NTPase活性最大 說明：因子識別和結(jié)合的是RNA （3） 因子對終止子的作用 a、因子與RNA結(jié)合（終止子上游的某一處，RNA的5端,b、因子沿RNA從53移動（NTP水解供能） （終止子處的較長時間的延宕給因子追趕的機會,c、因子與 RNApol 相互作用而造成轉(zhuǎn)錄的終止,結(jié)合上來追趕RNApol,追趕上來（暫停,與RNApol相互作用使雜交鏈解鏈,4） 終止反應還需要 RNA 與 DNA 的相互作用 即 ： 需要一定的RNA序列 因為： 其與模板的結(jié)合力必須弱到一定數(shù)值，才能配合 因子與 RNApol 的作用 （發(fā)夾結(jié)構(gòu)下游的AU序列） 序列不同的終止子不同的終止程度基因表達 調(diào)控的途徑之一,5） Prok