克隆技術(shù)簡介

1、 克 隆 技 術(shù) 介 紹 張 勛 學號：摘 要 克隆技術(shù)是生命科學技術(shù)領(lǐng)域里非常重要的部分，隨著新時代的到來，克隆技術(shù)在人類生產(chǎn)生活中將發(fā)揮更加重要的作用。人們享受著克隆技術(shù)帶來的巨大好處，但與此同時，克隆技術(shù)對人類的可持續(xù)發(fā)展也提出了問題和挑戰(zhàn)。本文是通過從實質(zhì)、方法、應用價值等方面對克隆技術(shù)進行一些介紹。一、克隆技術(shù)實質(zhì)1963 年J.B.S.Haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性”的演講上采用“克隆 (Clone)”的術(shù)語。學家把人工遺傳操作動物繁殖的過程叫“克隆”，這門生物技術(shù)叫“克隆技術(shù)”，其本身的含義是無性繁殖，即由同一個祖先細胞分裂繁殖而形成的純細胞系，該細胞系中

2、每個細胞的基因彼此相同。早在1938年，德國胚胎學家Speman最早提出克隆設想。1962年，英國劍橋大學的Gurdon進行了青蛙胚胎核移植，獲得成年蛙。在經(jīng)歷半個多世紀的研究后，終于在1996年的7月5日，在蘇格蘭羅斯林研究所中，隨著用體細胞克隆出來的小羊多莉的誕生，哺乳動物克隆技術(shù)真正的來到我們面前?？寺〖夹g(shù)作為人類在生物科學領(lǐng)域取得的一項重大技術(shù)突破，反映了細胞核分化技術(shù)、細胞培養(yǎng)和控制技術(shù)的進步，它對于擴大良種動物群體，提高畜群的遺傳素質(zhì)和生產(chǎn)能力，拯救瀕危動物等的方面而言是迄今為止最為理想手段。克隆也可以理解為復制，就是從原型中產(chǎn)生出同樣的復制品，它的外表及遺傳基因與原型完全相同，但

3、大多行為 思想不同。時至今日，“克隆”的含義已不僅僅是“無性繁殖”，凡是來自同一個祖先，無性繁殖出的一群個體，也叫“克隆”。這種來自同一個祖先的無性繁殖的后代群體也叫“無性繁殖系”，簡稱無性系。簡單講就是一種人工誘導的無性繁殖方式。但克隆與無性繁殖是不同的?？寺∈侵溉斯げ僮鲃游锓敝车倪^程，無性繁殖是指：不經(jīng)過兩性生殖細胞的結(jié)合由母體直接產(chǎn)生新個體的生殖方式。 植物基因的克隆技術(shù)是生命科學研究的重要組成部分，是現(xiàn)代生命科學技術(shù)中最核心的內(nèi)容，它是隨著20 世紀 70 年代初 DNA 體外重組技術(shù)的發(fā)明而發(fā)展起來的， 其目標是識別和分離特異基因并獲得基因完整序列，確定其在染色體上的位置，闡明其生化

4、功能，并利用生物工程手段應用到生產(chǎn)實踐中去。一般來講，基因克隆的策略可分為兩種途徑： 正向遺傳學途徑和反向遺傳學途徑。 正向遺傳學途徑以待克隆的基因所表現(xiàn)的功能為基礎(chǔ)， 通過鑒定基因的表達產(chǎn)物或表型性狀進行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遺傳學途徑則著眼于基因本身特定的序列或者在基因組中的特定位置進行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；隨著 DNA 測序技術(shù)和生物信息學的發(fā)展，又產(chǎn)生了電子克隆等新興克隆技術(shù)。 目前，在玉米，水稻、油菜、擬南芥、煙草、番茄等多種植物中，已經(jīng)克隆了許許多多與植物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性及農(nóng)藝性狀等相關(guān)的基因。現(xiàn)對在植物基因克隆過程中運用的主要技術(shù)進行綜述，以把握植物基

5、因克隆技術(shù)的發(fā)展歷程，并對未來的發(fā)展趨勢進行展望。二、部分克隆技術(shù)簡介1、功能克隆 功能克?。‵unctional Cloning）就是從蛋白質(zhì)的功能著手進行基因克隆， 是人類采用的第一個克隆基因的策略。其基本內(nèi)容為：根據(jù)已知的生化缺陷或特征確認與該功能有關(guān)的蛋白質(zhì)， 分離純化蛋白并測定出部分氨基酸序列，根據(jù)遺傳密碼推測其可能的編碼序列，設計相應的核苷酸探針， 雜交篩選 cDNA 文庫或基因組文庫，或者使用該蛋白質(zhì)特異的抗體，篩選表達載體構(gòu)建的 cDNA 文庫， 通過抗原抗體反應尋找特異的克隆，最后對選中的克隆測序，獲得目的基因的序列。2、定位克隆 定位克隆技術(shù) （positional clo

6、ning） 又叫圖位克?。╩ap-based cloning）， 是根據(jù)目標基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法， 適合于克隆編碼產(chǎn)物未知的基因。 其基本原理是根據(jù)功能基因在基因組中存在相對較穩(wěn)定的基因座， 在利用分子標記技術(shù)對目的基因進行精確定位的基礎(chǔ)上， 用與目標基因兩側(cè)緊密連鎖的分子標記篩選含有大的插入片段的基因組文庫（如 BAC 和 YAC），用篩選到的陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊群， 再通過染色體步行（chromosome walking） 逐步逼近候選區(qū)域或通過染色體登陸 （chro-mosome landing）的方法獲得含有目標基因的大片段克隆，將含有目標基因的大片段克

7、隆進行亞克隆，或以大片段克隆作探針篩選 cDNA 文庫； 從而將目標基因確定在一個較小的 DNA 片段上并進行序列分析，通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補試驗分析，鑒定獲得目的基因。定位克隆理論上適用于一切基因， 但由于定位克隆依賴于高密度的分子標記連鎖圖譜， 因此該技術(shù)對于基因組較小， 重復序列少而且已經(jīng)構(gòu)建了高密度RFLP 或 RAPD 等標記圖譜的植物無疑是非常有效的，3、轉(zhuǎn)座子標簽法（transposon tagging）轉(zhuǎn)座子（Transposon）是可從染色體的一個位置轉(zhuǎn)移到另一位置的 DNA 片段， 最早在玉米中發(fā)現(xiàn)的，隨后的研究表明，在生物界中轉(zhuǎn)座子是普遍存在的，并在生物的遺傳進化方面有重

8、要作用。 轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)克隆基因的基本原理是， 利用轉(zhuǎn)座子插入到基因內(nèi)部或鄰近位點，會引起相關(guān)表型突變的特點，以轉(zhuǎn)座子的已知序列為標簽，克隆因轉(zhuǎn)座子插入而功能失活的基因。如果某基因的突變是由于轉(zhuǎn)座子插入而造成的， 那么以轉(zhuǎn)座子序列為探針就可從變異株的基因組中篩選出帶有此轉(zhuǎn)座子的部分基因， 再以突變基因的部分序列作探針，即可從野生型文庫中克隆出完整的基因。在植物中利用轉(zhuǎn)座子的有玉米的 Ac/Ds，En/Spm 和金魚草的 Tn3 等，其中應用最多的是 Ac/Ds 雙因子系統(tǒng)。4、抑制性差減雜交抑制消減雜交技術(shù)（SSH）是 1996 年由 Diatchenko L 建立的以抑制性 PCR 為基礎(chǔ)的

9、 DNA 消減雜交方法。其依據(jù)的技術(shù)主要有兩點：1、消減雜交；2、抑制 PCR。經(jīng)抑制消減雜交后的 cDNA 群體不僅富集了差異表達基因（目的基因），而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除， 使消減后的 cDNA 群體為豐度一致的目的基因群體。與其他差異表達基因克隆技術(shù)相比，SSH 技術(shù)具有明顯的優(yōu)越性： 假陽性率大大降低，這是它的最大優(yōu)點。 這是由它的兩步消減雜交和兩次抑制 PCR 所保證的。 高敏感性。在 DDRT 和 cDNA-RDA 中，低豐度的 mRNA 一般不易被檢出，SSH 方法所做的均等化和目標片段的富集， 保證了低豐度 mRNA 也可能被檢出。 速度快，效率高。 一

10、次 SSH 反應可以同時分離幾十或成百個差異表達基因。 另外， 此技術(shù)還具有背景低、重復性好的特點。5、同源序列法同源序列法是根據(jù)與待克隆基因同源的已知序列進行基因克隆的方法。目前很多植物基因序列已知，當要克隆類似基因時可先從 Genbank 庫中找到有關(guān)基因序列，設計出特異引物；以植物基因組 DNA 或者 cDNA為模板， 采取 PCR 或 RT-PCR 的方法來擴增目的基因；擴增的片段經(jīng)純化后，連接到合適的載體上，進行序列分析、 比較驗證并確認目的基因的克隆。6、基因芯片技術(shù)（gene chips） 基因芯片又稱 DNA 芯片、DNA 微陣列 （DNA mi-croarray）， 是指將許

11、多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交， 再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描， 并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息。 基因芯片具有高通量、高信息量、快速、并行檢測、樣品用量少、用途廣泛等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應用到基因表達檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面?；蛐酒鶕?jù)功能可分為基因表達芯片（gene expres-sion microarray） 和 DNA 測序芯片 （DNA sequencingchip）2 類；按基因芯片的用途可分為表

12、達譜芯片、診斷芯片、指紋圖譜芯片、測序芯片等；根據(jù)所用探針的類型可分為 cDNA 微陣列芯片和寡核苷酸陣列芯片。7、電子克?。╡lectronic cloning）電子克隆， 又稱計算機雜交 （computer hybridiza-tion）， 是以數(shù)學算法為手段， 以計算機和互聯(lián)網(wǎng)為工具，利用現(xiàn)有的基因序列、表達序列標簽（EST）、蛋白序列和生物信息數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘新基因，并通過生物學試驗進行編碼序列和功能驗證而克隆基因的方法。 電子克隆的理論基礎(chǔ)是利用絕大部分功能基因的編碼區(qū)比較保守，同源性較高的特點，采用生物信息學的手段，通過同源性分析延伸 EST 序列，以獲得基因潛在的部分乃至全長的 cD

13、NA 序列。三、克隆技術(shù)的應用價值及影響 由于克隆技術(shù)可以“復制”出完全相同基因的大量個體群，因此克隆技術(shù)被廣泛運用于植物、動物、微生物的生產(chǎn)時間好科學研究中，為生物遺傳疾病的治療、優(yōu)良品種的培育和擴群等提供了重要途徑。克隆技術(shù)的應用主要表現(xiàn)在以下幾個方面：1、 對瀕危生物的種質(zhì)進行保存，搶救瀕危滅絕生物；2、 促進物種的優(yōu)化，快速、有效地繁育優(yōu)良生物；3、對轉(zhuǎn)基因生物進行擴群，培育轉(zhuǎn)基因生物；4、為醫(yī)學、科研提供有利技術(shù)支持，主要進行治療性克隆，解決醫(yī)學難題；5.有計劃地協(xié)調(diào)失衡的生態(tài)系統(tǒng)，促進人類可持續(xù)發(fā)展。 從上述五個方面來看，克隆技術(shù)發(fā)展至今，無論在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面還是在生物品種的改良和優(yōu)

14、化方面都表現(xiàn)出積極的作用，它作為推動生產(chǎn)發(fā)展的技術(shù)力量，在促進科技進步和社會發(fā)展方面有著極其重要的意義。 克隆技術(shù)在廣泛運用和迅速發(fā)展的過程中，其最為核心的影響表現(xiàn)在對人類的可持續(xù)發(fā)展的影響。 人類長期以來對生態(tài)環(huán)境的破壞以及對自然資源的掠奪造成了大量的生態(tài)問題，使得生態(tài)系統(tǒng)惡化。其中最為明顯的生態(tài)問題就是大量物種的滅絕，每天都有不同的生物從人類歷史的長河中消失，而在克隆技術(shù)產(chǎn)生以前這種物種滅失是不可逆的，人類無法“制造”已經(jīng)滅絕的物種。但是，當克隆技術(shù)產(chǎn)生后，利用瀕危生物的種質(zhì)對其進行大量的“復制”成為可能，這樣就大大改變了生物滅絕的威脅，從而也使自然生態(tài)系統(tǒng)得以恢復，還人類一個多樣化的世界

15、。其次，利用克隆技術(shù)可以對轉(zhuǎn)基因生物進行擴群，培育轉(zhuǎn)基因生物。利用克隆技術(shù)進行轉(zhuǎn)基因生物的培育是現(xiàn)代生物技術(shù)的一大要點，對人類產(chǎn)生了不可估量的影響，其中最重要的貢獻是聚積在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學運用上面。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，利用克隆技術(shù)可以大量復制基因純正的動物，并可非常容易地改造動物的基因，這樣可以培養(yǎng)大量品種優(yōu)良的家畜，同時轉(zhuǎn)基因品種的出現(xiàn)大大提高了動植物抗菌、抗病毒、抗蟲害等抗性，并且對于提高農(nóng)作物蛋白質(zhì)含量、改良氨基酸的組成等方發(fā)揮著重要作用。在醫(yī)學運用中，克隆技術(shù)和最新的人胚胎干細胞技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生的治療性克隆更成為人類醫(yī)療歷史上革命性的技術(shù)，是生命科學研究具有里程碑意義的重大突破。治療性克隆是現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展的一個重要方向，它打開了再生醫(yī)療的大門，具有無限的潛力。 克隆技術(shù)的產(chǎn)生正如其它科學技術(shù)一樣都是雙刃劍, 一方面對生物遺傳病的治療、優(yōu)