微生物實驗二細菌的簡單染色和革蘭氏染色

1、實驗二 細菌的簡單染色和革蘭氏染色,球菌,桿菌,弧菌,實驗二 細菌的簡單染色和革蘭氏染色,一、實驗目的 1. 學習掌握單染色的操作技術(shù)和無菌操作技術(shù)。 2. 了解革蘭氏染色機理，并掌握其操作技術(shù),二、實驗原理-簡單染色,細菌的細胞小而透明，在普通的光學顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色。利用單一染料對細菌進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。 常用堿性染料進行簡單染色，這是因為在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易

2、與細菌結(jié)合使細菌著色。經(jīng)染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅等。當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色,二、實驗原理-簡單染色,染色前必須固定細菌。其目的有二：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時盡量維持細胞原有的形,二、實驗原理-革蘭氏染色,革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家ChristainGram氏創(chuàng)立的，革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏

3、染色法是細菌學中最重要的鑒別染色法。 革蘭氏染色法所以能將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的,二、實驗原理-革蘭氏染色,革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結(jié)晶紫進行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色，最后用復染劑(如番紅)復染。經(jīng)此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌,二、實驗原理-革蘭氏染色,當用結(jié)晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復合物，從而增強了染料與細菌的結(jié)合力。當

4、用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色,三、實驗器材,1、菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌斜面菌種。 2、顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、蓋玻片、試

5、管、水浴鍋。 3、草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、0.5%番紅色液、蒸餾水、雙層瓶（香柏油和二甲苯,四、實驗方法和步驟,細菌的簡單染色 1、涂片：用1%鹽酸清潔玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸餾水，再用無菌操作的方法挑菌少許于玻片的水中，并充分混勻涂成薄膜。 2、干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通過微火2-3次。 4、染色：待玻片泠卻后加結(jié)晶紫1-2滴于涂片上，覆蓋涂面染色1-2分鐘。 5、水洗：傾去染色液，用水自玻片一端輕輕沖洗至流下的水變無色為止（注：勿沖去菌體）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水紙吸干。 7、鏡檢：油鏡觀察并繪圖,四、實驗步驟,1、

6、菌落形態(tài)觀察： 2、細菌簡單染色： 3、細菌革蘭氏染色,注意：菌落顏色、濕度、形狀、大小、透明度、顏色、邊緣是否規(guī)則等特征,染色過程： 涂片干燥固定染色（1min）水洗干燥鏡檢 注意事項： 涂片：取菌量不能太大 干燥：自然干燥 水洗：水流不能直接沖在涂菌處,2. 革蘭氏染色,1）、涂片：取清潔玻片一塊，在玻片兩端1/4處下面用記號筆分別標明S和E（見圖示），并滴一滴蒸餾水，分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌涂布在相應的區(qū)域內(nèi),2. 革蘭氏染色,2、干燥與固定：方法同（一）中2，3步驟 3、染色： 結(jié)晶紫染色1-2分鐘-水洗-碘液媒染1-2分鐘-水洗-酒精脫色15-20秒-水洗-番紅復染色2-3分鐘-水洗-干燥-鏡檢記錄,染色結(jié)果,金黃色葡萄球菌革蘭氏染色結(jié)果,染色結(jié)果,大腸桿菌革蘭氏染色結(jié)果,染色結(jié)果,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合菌樣的革蘭氏染色結(jié)果,四、實驗結(jié)果,繪圖記錄觀察結(jié)果,顯微鏡放大倍數(shù)物鏡放大倍數(shù)目鏡放大倍數(shù),思考題,1、在制作涂片中，為什么要進行固定這一步？ 2、革蘭氏染色中哪一步關(guān)鍵，為什么,附：油鏡的使用,雙目顯微鏡,單目顯微鏡,2.油鏡的原理,油鏡的透鏡很小，從載玻片透過的光線通過空氣時，因介質(zhì)折光率不同，光線將發(fā)生散射現(xiàn)象