定量數(shù)據(jù)分析熒光定量PCR技術 常見問題與解答

1、 螺旋課堂第一課熒光定量 PCR 技術 PCR 技術的發(fā)明極大地推動了分子生物學的發(fā)展，而且迅速被推廣和應用到生命科學的各個領域，可以說它是目前核酸分子水平的基礎及應用研究中使用最廣泛的一項技術。 常規(guī) PCR 中，在擴增反應結束之后，我們一般通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，無法對 PCR 擴增反應進行實時檢測，也無法對起始模板 準確定量，而很多情況下，我們所感興趣的是起始模板量，如轉基因動植物中插入某種外源基因的拷貝數(shù)或者病人中某種病毒 DNA/RNA 的精確 copy 數(shù)等，如此，熒光定量 PCR 技術便應運而生。 本文將分為三大部分向大家介紹，首先是理論篇：首先了解熒光定量

2、PCR 的理論知識，如熒光定量 PCR 技術的原理、方法等；隨后為實踐篇：如實驗的操作流程、注意事項、方法選擇、結果分析與處理等；第三部分為問題分析與解答篇：熒光定量 PCR 過程中有哪些常見問題，我們如何避免和解決。 理論篇第一章 一、熒光定量PCR 技術發(fā)展史 方法和封閉式檢測方式對PCR Higuchi 1993 年，日本 等人首次采用動態(tài) 技術的概念。當時他使PCR 目的核酸數(shù)量進行定量分析，首次提出了熒光定量 UV 用了 EB （溴乙錠）作為熒光標記染料，采用一臺經過改良的熱循環(huán)儀，用反應中的數(shù) PCR 射線照射樣品然后通過CCD 相機檢測產生的熒光值，利用了但學函數(shù)關系，再結合加入

3、標準品的方法，達到了對檢測樣品進行準確定量的目的， 產物PCR 由于這種方法由于有著在實驗儀器資金上巨大的耗費，一些非特異的 同樣能被檢測到并包含在被測的熒光信號值總量之中而導致定量不準確等因素， 最終使這種實驗技術在當時沒能成為主流的實驗技術。年又推出了首臺熒光技術，1996 公司成功研制了1995 年美國 PE TaqMan PCR 定量 檢測系統(tǒng)，通過檢測每個循環(huán)的熒光強度，并使用 Ct 值進行分析， 才很快得到大家的接受，并廣為應用。PCR 熒光定量 技術不斷完善，取得了突飛猛進的發(fā)展。由于其具 近年來，熒光定量PCR 有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低等優(yōu)點，而被廣泛

4、應用于基礎科學研究、藥物研發(fā)、臨床診斷、轉基因研究、基因檢測等各個領域研究當 中。 二、熒光定量 PCR 概述 、熒光定量PCR 概念1反應體系中加入熒光基r PCRPCReal-time ），是指在 技術（PCR所謂定量 進程，最后通過特定數(shù)學原理對未知團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR 1（圖模板進行定量分析的方法 ）。 反應原理 熒光定量1 圖 PCR 熒光基團 值Ct 熒光檢測元件 2、熒光定量 PCR 與普通 PCR 的主要區(qū)別 常規(guī) PCR 中，PCR 產物通過凝膠電泳，然后進行成像分析，常規(guī) PCR 只能通過終點法對擴增產物進行定性分析，而不能進行定量分析（圖 2）；熒光定量

5、 PCR 中，PCR 反應體系中加入了熒光分子，通過熒光信號的變化來反應擴增產物的變化，使 PCR 產物的實時檢測成為可能。相對常規(guī) PCR 而言，熒光定量 PCR 的主要優(yōu)點使準確地確定初始模版拷貝數(shù)和較高的檢測靈敏度；熒光定量 PCR 不僅可用于定性，如判斷一段序列的有無，也可用于定量，如確定起始模版的拷貝數(shù)； 圖 2 終點法定量 PCR 的缺陷 理論上 PCR 是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的 PCR 擴增曲線并不是標準的指數(shù)曲線，而是 S 形曲線。這是因為隨著 PCR 循環(huán)的增多，擴增規(guī)模迅速增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至 DNA 模板等各種 PCR 要素逐漸不敷需求， PCR

6、 的效率越來越低，產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的 Taq 酶都被飽和以后，PCR 就進入了平臺期。由于各種環(huán)境因素的復雜相互作用，不同的 PCR 反應體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以， 即使是 96 次 PCR 重復實驗，各種條件基本一致，所得結果有很大差異（圖 2）。 常規(guī) PCR 的定量方法，測定的都是 PCR 的終產物，而不是起始 DNA 拷貝數(shù)。由于 PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系（圖 2），所以不能根據(jù)最終 PCR 產物的量直接計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。雖然加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量

7、方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 而從圖 2 也可以看出，雖然相同模版在同一臺 PCR 儀上進行 96 次擴增， 終點處檢測產物量不恒定，但 96 次 PCR 擴增曲線都有一個共同的拐點，即熒光定量 PCR 中 Ct 值的重現(xiàn)性，恒定的 Ct 值為熒光定量 PCR 的分析提供了理 論依據(jù)。 前面我們對熒光定量 PCR 的歷史、熒光定量 PCR 概念和與常規(guī) PCR 區(qū)別有了大致的了解，但你可能心中存在許多疑惑：什么是擴增曲線？什么是 Ct 值？ 它們有什么特點？我們如何來判定熒光定量 PCR 反應中的 Ct 值，原理是什么？。 為了使大家更好的理解、掌握熒光定量 PCR 技術，在介紹熒

8、光定量 PCR 檢測方法、動力學原理和數(shù)據(jù)分析方法前，有必要先介紹幾個最基本的概念。 3、熒光定量 PCR 的幾個基本概念 3.1 擴增曲線 描PCR 原理，我將用樣品擴增曲線來進行說明。為了更好的理解熒光定量 的擴增曲線實際上并不是一條標準的PCR PCR 動態(tài)進程的曲線即擴增曲線。述 軸，YPCR 循環(huán)數(shù)軸表示）。圖 3 中，X 3S 指數(shù)曲線，而是呈 型曲線（圖 ，與反應管中擴增產物的量有比例關系。表示擴增反應的熒光值 擴增曲線示意圖熒光定量 PCR 圖 3 熒光閾值 擴增曲線可以分成三個階段：熒PCR 3 從圖 可以很直觀的看出，熒光定量 ，熒光信號指數(shù)擴增階段（對數(shù)期）和平臺期。在基

9、光背景信號階段（基線期）線期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。而在的終產物量與起始模板量之間平臺期，擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR 拷貝數(shù)。只有 DNA 產物量不能計算出起始 沒有線性關系，所以根據(jù)最終的PCR 產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR 我們可以選擇在這個階段進行定量分析。 3.2 熒光閾值 （圖 3），我們一般把熒光在介紹熒光閾值之前，先了解一下熒光本底信號，即樣本的熒光，基線期）15 個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline PCR 的前背景值和陰性對照的熒光值，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。熒

10、光閾值在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任 是 倍15 個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10 3 意位置上，熒光域值的缺省設置是 實驗時，經常采用手動設置，手動設PCR 。我們在做熒光定量 （機器自動設置）置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進 ）。入指數(shù)期的最初階段，真正的信號是熒光信號超過域值（圖 4 4 手工調整熒光閾值示意圖圖 Ct 值3.3 ，threshold，t 代表Ct 了解了熒光閾值的概念后，值就很好理解了。C 代表Cycle擴增過程中，當擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時PCR Ct 值就是在熒光 所謂 所示，黑

11、色的線顯示的是熒光閾值，當信號超過黑3 圖 所經過的擴增循環(huán)次數(shù)。如我們 Ct 值是可以變化的，色線時所經歷的循環(huán)數(shù)即為 Ct 值。從這也可以了解到 值來計 Ct 實驗時帶有一定的人為因素。而熒光定量PCR 后面的數(shù)據(jù)處理要用到儀的自 PCR 算，所以有關熒光閾值的設置就顯得尤為重要。一般說來，新手按熒光值即達 Ct 動設置為好，而如果你非常有經驗，一般會手動設置熒光閾值。因為起始到熒光閾值所經過的循環(huán)數(shù)，所以它就與模版的拷貝數(shù)存在著線性關系， 值范CT Ct 值也就越小，反之亦然。正常的 拷貝數(shù)越多，經過的循環(huán)數(shù)就越少， 之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。圍在 18-30 擴增，擴增產

12、物雖然不恒定，但 次PCR 前面也提到過，同一模板經過 96 值極具重現(xiàn)性。根據(jù)這個特點，我們可以利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品的Ct 值，就可以根Ct PCR 實驗中得到未知樣品的 Ct 值做出標準曲線，只要在同一次 據(jù)曲線算出該未知樣品的起始拷貝數(shù)。 Ct 值算出拷貝數(shù)的數(shù)學原理是怎樣的： 接下來我們就來看看通過 PCR） 擴增原理首先我們來回顧一下PCR（圖5，從原理圖中我們也可以很清 n 2次方增長的方式擴增，即：楚的知道理想的PCR反應是以n 2X=X0反應體系PCR 反應體系是一個有限的體系，也就是我們加入到 但由于 PCR 的擴PCR Buffer 等，只有在對數(shù)增長期時，中的物質

13、是有限的，例如酶、引物、擴 PCR 增效率才等于 1，大部分時候擴增效率小于一，有時甚至等于零。因此 增的真正情況是：n (1+Ex)X=X0 次循環(huán)后的產物量 n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)；X：第 n 其中 ：擴增效率X：初始模板量；Ex0 Ct個循環(huán)，此時的產物量為在擴增產物達到閾值線時所經歷的循環(huán)數(shù)為 (1+Ex)Ct =M X=X0Ct, ：熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量，在閾值線設定以后其中XCt 它是一個常數(shù)，我們設為M，我們對該方程式做簡單對方程式兩邊同時取對數(shù)得 logM=logX0 (1+Ex)Ct 的數(shù)學運算后得到：= - log(1+Ex) *Ct+ log M log

14、 X0反應中的某一個循環(huán)中PCR 為常數(shù)， M Ex 為常變數(shù)，也就是說 Ex 在 其中 是一個常數(shù)，但不同的循環(huán)數(shù)中，Ex 的數(shù)值會發(fā)生變化。因此從上式可以推出：值就可計Log 濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即 Ct 算出樣品中所含的模板量。 原理圖圖 5 PCR 標準曲線3.4 在絕對定量中，未知樣本的量如基因拷貝數(shù)可通過梯度稀釋的已知量的標準品值推算出。在實驗過程中，我們可以將已知濃度的標準品進行梯度稀釋個 Ct 的6 （5 實驗中PCR ，將未知樣品和梯度稀釋的標準品在同一熒光稀釋梯度） 值構建標準曲線，通過標準曲線可以推算出進行反應，將稀釋標準品得到的 Ct ）

15、。標準曲線的制作不需要人工操作，由儀器自動完成。未知樣品的量（圖 6PCR ，如果理論上，一系列稀釋樣品的擴增曲線之間有均勻的間距（圖 6 左） 反應呈理想的方式擴增，產物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距則符合等2 nn 1010 值差。例如：倍稀釋的樣本，2，可式“ 稀釋倍數(shù)”，n為 2 樣本間Ct 。 3.32 ， Ct 得 n值差3.32 標準曲線示意圖 PCR 圖 6 熒光定量 3.5 擴增效率 PCR 實驗，在絕對定量中，我們將已知模板稀釋成一系列濃度梯度進行熒光 ）或值做成標準曲線，利用遞減的直線關系等式和相關系數(shù)（r利用拷貝數(shù)和 Ct 可信度來計算擴增效率。 -1/斜率。10

16、 ） E 擴增效率與標準曲線的斜率相關，計算方程為：擴增效率（理論上，在每個指數(shù)擴增循環(huán)中，PCR產物的量加倍，即PCR產物 2 倍增加，反-1/斜率，標準曲線得斜率就為-3.32，斜，就可得2 210應效率為 2，擴增效率就為 率得絕對值與熒光曲線間距相同。 如果將擴增效率用百分率來表示，即：E%=(E-1)100%，對于理想的 PCR 反應，E=2，即：擴增效率 E%=(2-1)100%=100% 如果 E1.92，帶入方程(1.92-1)100%=92%，表示每個循環(huán)的終點，擴增產物的拷貝數(shù)增加 1.92 倍，或每次循環(huán)有 92的模板被擴增。 一般說來，擴增效率接近 100是優(yōu)化的重復性

17、好實驗的最好標志，實際操作時，反應的擴增效率應該在 90105之間，如果擴增效率低，可能的原因是引物設計不當，或者反應條件未優(yōu)化；擴增效率大于 100時，可能的原因是系列稀釋樣品加樣錯誤，或者有非特異性產物擴增，如引物二聚體產生。用上述方法確定擴增效率時，反應體系中的抑制劑的出現(xiàn)也可能導致擴增效率明顯增加，原因是高濃度模板樣本中抑制劑的濃度低，導致反應的 Ct 值延遲出現(xiàn)，而低濃度模板樣本中抑制劑濃度高，反應的 Ct 值延遲程度小，導致斜率的絕對值以及計算所得的擴增效率會增加。如果擴增效率小于 90或大于 105，建議重新設計引物或探針。 三、熒光定量 PCR 的方法 熒光定量 PCR 所使用

18、的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在PCR 反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物；而非特異性檢測方法是在在 PCR 反應體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發(fā)射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。 熒光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 結合染料 SYBR Green的非特異性方 法和 Taqman 水解探針的特異性方法，在這里主要介紹這 2 種方法，其它方法請 參考其它熒光定量 PCR 資料。 1、非特異性 SYBR Gree

19、n I 染料 法 SYBR Green I 是一種結合于所有dsDNA 雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料（圖 7），在游離狀態(tài)下，SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA 結合后，熒光大大增強（圖 8）。因此，SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數(shù)量相關，可以根據(jù)熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm，發(fā)射波長最大約為 520nm。 圖 8 SYBR Green I 作用機理示意圖 SYBR Green I 的優(yōu)點： 實驗設計簡單，僅需要設計上下游一對引物，不需要設計探針，

20、無需設計多個探針即可快速檢驗多個基因，通用性好；成本低；能夠通過溶解曲線分析檢驗擴增產物的特異性。因而在低通量實驗和單重實驗時一般優(yōu)先考慮使用 SYBR Green I 染料法。 SYBR Green I 的缺點：由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結合， 因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性，SYBR Green I 方法對 PCR 擴增特異性要求較高。實驗過程中通過熔解曲線來分析產物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量結果。另外， 因為 SYBR Green I 不能區(qū)分不同擴增子發(fā)出的熒光而導致它不能用于多

21、重反 應。 溶解曲線分析可以用來確定不同的反應產物，包括非特異性產物。擴增反應 完成后，通過逐漸增加溫度同時監(jiān)測每一步的熒光信號來產生溶解曲線，隨著反應 變性，熒光染料又回復到游離狀態(tài)導致熒光信號降低，用熒光信號 DNA 中雙鏈 改變的負的一次導數(shù)與溫度作圖，在擴增產物的溶解溫度上有一特征峰（Tm， ，用這個特征峰就可以將特異產物與其它產物如引的溫度）DNA 雙鏈解鏈 50 。 9）（圖物二聚體區(qū)分開，因為它們在不同的溫度溶解 9 SYBR Green I 擴增產物溶解曲線分析圖 Taqman 水解探針法2、特異性 熒光探針為Taqman 熒光探針為基礎，Taqman Taqman 熒光定量技

22、術是以 一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，外切3 擴增時，Taq 酶的 5PCR 發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測實現(xiàn) 系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，產物形成完全同步。從而實現(xiàn)定量。當探針與靶序了熒光信號的累積與 PCR 端的淬滅基團接近而被淬滅。在進行延 3列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，5伸反應時，聚合酶的 。隨著擴增產物10） 發(fā)出熒光。一分子產物生成伴隨一分子熒光信號產生（圖 的增加，熒

23、光增強。PCR 擴增程序通常將復性與延伸合二為一。常用的 熒光基團是 FAM, TET, VIC, HEX。 圖 10 Taqman 探針工作原理 由于 Taqman 探針法中，除引物外，還使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測目標序列，防止非特異產物的干擾影響定量的準確性，同時它也可以用于多重反應，但探針設計成本較高，有時探針設計困難。 第二章 實踐篇 ）測定未知樣品的絕對我們在設計實驗的時候通常對下列事情更感興趣：1）未知量：如給定的血樣中的病毒顆粒數(shù)，食品中某一種轉基因成分的含量；2樣品與已知樣品相比，基因的表達量改變了多少倍：如相當量的腫瘤組織和正常改變了多少倍。分析這兩種假設

24、的方法就分別叫絕對定量和組織相比，p53mRNA 相對定量。值和標準曲線進行比較實現(xiàn)的。分析的結果是給 Ct 絕對定量是通過樣品的 ）中核酸的量（拷貝數(shù)、微RNA 定數(shù)量的樣品中（給定數(shù)量的細胞，每微克總 克）。 B ）中 ）和對照組（樣品A 相對定量的分析結果是在相當量的試驗組（樣品 一個靶基因的相對比率（倍數(shù)差異）。接下來我們就來看看我們在實驗過程中如何來使用絕對定量和相對定量的 分析方法。 一、絕對定量分析 1、絕對定量分析方法的使用條件在這里我將舉例來說明我們在實驗過程中，何種實驗需要用絕對定量來進行的精確拷貝數(shù)感興趣。首HBV DNA 分析。醫(yī)生對一個乙肝病人的每毫升血液中 病HBV

25、 PCR 實驗來確定 先醫(yī)生要從病人血液中提取 DNA，然后通過熒光定量對照樣HBV Ct 值和設置梯度稀釋的已知 DNA 的 copy 數(shù)。通過病人樣品的 毒數(shù)。的 copy 病毒品的標準曲線進行比較，醫(yī)生就能確定病人血液中 HBV DNA 從這個例子，我們也可以看出，在實驗過程中，如果最終的結果是對未知樣品的定、引量描述，并不依賴別的樣品的性質的時候，就應該使用絕對定量進行分析。 2 物和探針的設計探針法要同時考慮探針和引物的質量。首先要尋找合適的探針使用 Taqman 位置，再設計引物，并使引物盡可能靠近探針。 引物設計原則2.1引物引物的設計大家應該非常清楚了，在這里就不再贅述，但熒光

26、定量 PCR PCR 引物設計有所差別和要求。的設計還是與普通 探針設計原則2.2 范圍內； ?探針位置盡可能地靠近上游引物，擴增片段長度在 50150bp ?探針長度通常在 2030bp，Tm 值在 ? ， 高510，通常比引物6570 Tm ? GC含量在 40%70%。 ? 探針的 5端應避免使用堿基 ? G。 ? 3 個堿基以上的互補序列。探針內部或探針與 2 條引物之間避免 G ?的含量。整條探針中，堿基 C 的含量要明顯高于 中核實一次，如果發(fā)現(xiàn) blast ? 為確保引物探針的特異性，最好將設計好的序列在 有非特異性互補區(qū)，建議重新設計引物探針。 、標準品的制作：3 標準品制作流

27、程3.1 重組質粒篩選 目的基因擴增PCR 目的基因克隆 提取、質粒DNADNA 計算質粒梯度稀釋 重組質粒鑒定 拷貝數(shù) 制作標準品 標準品拷貝數(shù)的計算 3.2稀釋倍數(shù)ng/ul）OD40待測樣本濃度（260324 樣本分子量=堿基數(shù)14 106待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量 標準品的梯度稀釋：3.3ii 1v 原液(標準品 i) +9v 稀釋緩沖液，得標準品iii 1v 標準品 ii+9v 稀釋緩沖液，得標準品 iv iii +9v 稀釋緩沖液，得標準品1v 標準品 v 稀釋緩沖液，得標準品 標準品1v iv +9v ，這樣有助于保證標準品1ul，體積最好加大

28、，如 10ul1v注意：稀釋的時候，體積不要只加 . 10 倍梯度稀釋是均一的 PCR 4、熒光定量 模板的制備 請查閱提取、逆轉錄的相關資料。 DNA/RNA 體系準備 5、熒光定量PCR PCR 條件摸索：反應，驗證引物是否合適、模板是否降解、模板純度是否PCR 不加探針的常規(guī)，所合適。同時確定最佳反應體系和反應條件。由于當前大部分實驗為使用mix 以只用摸索模板、引物條件即可。如果是首次實驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗條件模板濃度： 摸索，以選擇出最合適的模板濃度，條件困難時，也至少要選擇兩個稀釋度（高 或中、低濃度）來進行實驗。一般而言，Ct 值在 1530 范圍內比較合

29、適，若大于 30 則應加大模板使用量，如果 Ct 小于 15 則應對模板進行稀釋后再進行實驗。 引物的濃度：引物的濃度是一個影響 PCR 反應的關鍵因素，若濃度太低，會致使反應不完全，若引物太多，則發(fā)生錯配以及產生非特異的產物的可能性會大大增加。對于大多數(shù) PCR 反應，可在 0.11.0uM 之間進行選擇，直至得到滿意的結果。 探針濃度：初次實驗每個探針用 0.2uM，如果信號強度達不到要求，可以適當增加至 0.4uM 34、10、5 510HBV將已知濃度的陽性標準品做系列濃度稀釋，分別含有 56 copies /ml，建立 20ul10反應體系（參照優(yōu)化體系），3 次重復（熒510、5光

30、PCR一般進行 3 次以上重復，有的甚至達到了 6 次以上重復）。 以某病人的血液提取的 HBV 病毒 DNA 為模板，建立 20ul 熒光定量 PCR 反 應體系（參照優(yōu)化體系），每個樣品 3 次重復，同時設置不加模板的陰性對照。 6、熒光定量 PCR 體系配制及儀器程序設置 請參照各公司熒光定量PCR 試劑、熒光定量 PCR 儀器說明書進行。 7、實驗結果與數(shù)據(jù)處理 PCR 反應結束后，得到如下數(shù)據(jù)： copies/ml Ct1 Ct2 Ct3 Mean Ct STD 0.13 27.61 5103 27.84 27.58 27.67667 24.55 24.25 0.08 5104 24

31、.40667 24.42 21.16 0.06 21.04 5105 21.11 21.10333 18.21 0.08 18.06 106 518.05 18.10667 None BLANK None None 23.25 0.05 23.46 sample 23.39 23.36667 注：平行樣的 Ct 值之間的差0.5 時表示重復性較好 直接從熒光 PCR 儀上就可以得到標準曲線： 29 y = -3.2013x + 30.827 27 2R = 0.9995 25 23 值 tC21 19 17 15 5103 51045106 5105拷貝數(shù)2 sloper理想的標準曲線的優(yōu)劣有

32、兩個指標，相關系數(shù)（）和斜率（）。相關 系數(shù)反映標準曲線的直線性，理想值應大于 0.98，越接近 1 說明直線性越好， 定量越準確。斜率反映PCR擴增效率（E），理想的PCR擴增效率在 90105之間，如果PCR擴增效率低，必須重新設計引物或探針；如果擴增效率高于理想值， 可能是系列稀釋樣品加樣錯誤，或者非特異性產物擴增，或反應體系中可能存在著對反轉錄反應或PCR反應阻害的物質，需要相應的解決辦法。 20.9995，大于 0.98，標準差都在 0.2 范圍內， 從標準曲線可以看出： r-1/-3.2013=2.04，擴增效率（2.041）100%=104%，表示定量準確，可而E=10將未知樣品

33、的Ct值帶入方程： 23.36667= -3.2013 X + 30.827 可得 X2.33 44/2) 2.335.82510(510所以copies 但我們需要注意的是，標準曲線只可能用于推算稀釋梯度范圍內的未知樣本的量，而不能外推稀釋梯度外的未知樣本的含量。所以，我們在實驗過程中盡可能使未知樣品的濃度在標準品的稀釋范圍內。 二、相對定量分析 1、相對定量分析方法的使用條件 同絕對定量分析類似，我將舉例來說明我們在實驗過程中何種實驗需要用相對定量來進行分析。我們如果想知道經過藥物處理過的組織和未處理的組織中某一目的基因的表達水平是否有差異，相差多少倍？我們可以選擇以下 2 種方式： 1)

34、我們可以從等量的 2 種組織中提取 RNA，分別進行目的基因的反轉錄特異性熒光定量 PCR 實驗來確定目的基因在 2 種組織中的表達量，結果可以反映等量的 2 種組織中目的基因表達量的比率。 2）如果我們之前已經確定 2 種組織中看家基因如 GAPDH 的表達量相等，那么， 我們就可以從大約等量（不需要等量）的2 種組織中分別提取RNA，通過RT-qPCR實驗來確定 2 種組織中目的基因和看見基因的表達水平。藥物處理組織的目的基 因的表達量可由 2 種組織中看家基因和未處理組織中目的基因的表達量共同來確定。 2 種分析方法的差異就在于用的標準有所不同，方法 1）中的標準是 2 種組織的量相等；

35、方法 2）中的標準是 2 種組織中看家基因如 GAPDH 的表達量恒定不變； 2、相對定量數(shù)據(jù)處理方法： 對于不同的實驗需求，我們可以采用不同的方法進行實驗設計和數(shù)據(jù)分析， -Ct、用參照基因的Ct法和2一般常用的方法有雙標準曲線法、Ct、Pfaffi 法，應用每種方法都有適應條件。 如為檢測 A 基因在某因子干預下的表達，我們得到一組數(shù)據(jù)見下表： E） 參照基因擴增效率（ 參照基因（Ct 值） 待測基因擴增效率（E待測基因（Ct 值） D C A B 干預前 干預后D F E C 根據(jù)實驗要求我們可以選擇相應的方法，如下表：數(shù)據(jù)處理方法 參考條件 計算方法 -Ct-(E-A) =2表達水平2

36、 擴增效率為 100% Ct 法，僅需目標基因即可Ct-2表達水平，且相 目的基因和參照基因擴增效率都接近 100 Ct -2-(E-F)-(A-B) 2對偏差不超過 5，需要目標基因和參照基因。 -Ct (F-B)-(E-A) 2同 2表達水平參照基因的Ct 目標基因和參照基因擴增效率不同，但目標基因間(F-B) (A-E)/D表達水平C 的擴增效率相同，需目標基因和參照基因，以及擴Pfaffi 法 增效率。Ct-分析方法，下面就以此分析方法而目前相對定量普遍采用操作簡便的 2 為例進行分析，應用SYBR Green方法對不同樣本間X基因表達分析的詳細說明和舉例。 3、引物的設計 在這里不再

37、贅述，但需要提醒大家再設計擴增片段長度時，最好在 100 200bp 范圍內，在這范圍內，擴增片段越短，有效擴增反應越容易實現(xiàn)，同時較短的擴增片段也可保證分析的一致性。 4、模板的制備 請查閱 DNA/RNA 提取、逆轉錄的相關資料。 5、PCR 體系準備 PCR 條件摸索： 同絕對定量分析條件摸索，只是值得注意的是由于 SYBR 染料法對引物要求要比探針法高，在熒光定量實驗前，我們可通過普通 PCR 實驗來評價引物質量。 以 RTPCR 獲得的 cDNA 為模板，建立 20ul 熒光定量 PCR 反應體系，每個樣品 6 次重復（藥物處理和未處理），對 X 基因和 GAPDH 基因進行擴增，同

38、時設置不加模板的陰性對照。 6、熒光定量 PCR 體系配制及儀器程序設置 請參照各公司熒光定量 PCR 試劑、熒光定量 PCR 儀器說明書進行。7、實驗結果與數(shù)據(jù)處理 7.1 溶解曲線繪制與分析 SYBR Green 染料沒有序列特異性，可以結合到包括非特異產物和引物二聚體在內的任何 dsDNA 上，因此有必要區(qū)分目標信號和假信號。內嵌染料可以在反應末尾對擴增產物進行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨 著溫度從低于產物溶解點緩慢升到高于產物溶解點，實時儀器連續(xù)監(jiān)測每個樣品含量的不同，擴增產物會在不同的溫度點解鏈。的熒光值?；诋a物長度和 G/C 隨著產物的解鏈，可以看到熒光值的降

39、低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微分可 以計算出溶解峰。溶解峰反映了反應中擴增到的產物。這些峰與凝膠電泳中條帶類似。1 95，每升高 PCR 完成后進行，從 60升至熔解曲線的設置是在整個 值下降儀器會自動收集熒光信號，得到的熔解曲線是逐漸下降的過程，且在 Tm 這最快，為方便分析，我們將溫度與熒光強度的變化求導，即得到單峰的熔解曲線， 樣我們就可以證明引物的特異性良好，實驗結果不受非特異性擴增和引物二聚 體的干擾。 X GAPDH 數(shù)據(jù)處理7.2 Ct -2Ct Ct 值 樣品X Mean Ct 基因GAPDH 基因 Mean Ct 值 未處理6.18 20.34 26.52 樣品 藥物處4

40、.35 4.06 -2.12 20.12 24.18 理樣品None None BLANK 下面我們來看看上面表格中差異倍數(shù)是如何得來的： 首先，分別求出 6 個重復樣品 X 基因和 GAPDH 基因平均 Ct 值后，應用參照基因 GAPDH 對未處理樣品和藥物處理樣品進行校正： CtX基因 Mean Ct值GAPDH基因 Mean Ct值26.52 （未處理樣品）20.346.18 X基因 Mean Ct值 GAPDH基因 Mean Ct值24.18 Ct ）（藥物處理樣品20.124.06 然后，對未處理樣品和藥物處理樣品的Ct 進行歸一化： -2 6.18 Ct 4.06 Ct Ct .

41、12 （藥物處理樣品）（未處理樣品）基因的X Ct 最后，我們就可以根據(jù)算出藥物處理樣品與未處理樣品間 表達差異： 2.12)-Ct(4.3522 X 基因的表達水平是未處理樣品的 4.35 此藥物處理樣本的倍。 因 此結果是通過參照基因表達水平校正的待測樣本中的目標基因相對于校準樣本，用參照基因校準目標基因表達的目的是彌補樣本組織量的差異。 為了更直觀的表示樣品間的表達差異，最后我們可以將計算得到的相對量用圖表來表示，如下圖： 54.5 4 3.5 量3 達表2.5 對2 相1.5 1 0.5 0 藥物處理樣品 未處理樣品 樣品名稱Ct-法的修正：2 如果目標基因可參照基因有相同的擴增效率，

42、但擴增效率不等于 2，那么， -Ct法的公式可以修正為用實際擴增效率值代替等式中的 22。例如，如果目標-Ct 。1.98 ，計算公式可以修正為1.98 基因和參照基因的擴增效率都為 第三章 常見問題與解答篇 一、無 Ct 值（信號）出現(xiàn) 1、反應循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在 35 個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但 高于 45 個循環(huán)會增加過多的背景信號； 2、檢測熒光信號的步驟有誤：一般采用 72延伸時采集熒光，Taqman 方法則一般在退火結束或延伸結束采集信號； 3、引物或探針降解：可通過 PAGE 電泳檢測其完整性； 4、探針設計不佳：設計探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產物已延伸； 5、模板量少：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣品的最高濃度做起； 6、模板降解：避免樣