實(shí)驗(yàn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)。了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。 二、實(shí)驗(yàn)原理 感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells): 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competent cell) 。 轉(zhuǎn)化（transformation）： 是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 進(jìn)入細(xì)胞的DNA分

2、子通過復(fù)制表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。 轉(zhuǎn)化的方法： 化學(xué)的方法:使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞； 電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。 克隆的篩選： 主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等； 將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。否則，如果將轉(zhuǎn)化后

3、的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細(xì)菌菌落，將難以確認(rèn)哪一個(gè)克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。 三、操作步驟1）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法) E.coli DH5菌平板上挑取一單菌落，接種于3ml LB1）從液體培養(yǎng)基（中，37振蕩培養(yǎng)過夜。將該菌懸液以1:1001:50轉(zhuǎn)接于200ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔2030min測一次OD600nm，至OD600nm0.5時(shí)停止培養(yǎng)（約23小時(shí)）； （2）每人取1個(gè)離心管，轉(zhuǎn)入1ml培養(yǎng)液，在冰上冷卻2-3min，于4，5000rpmmin離心5min（從這一步開始，所有操作均在冰上進(jìn)行

4、，速度盡量快而穩(wěn)）； （3）吸干上清培養(yǎng)液，用0.5 ml冰冷的0.1 M CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴15 min ； （4）5000rpmmin離心5min； （6）棄去上清液，加入100l冰冷的0.1 M CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置超過1小時(shí)后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液； （7）制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入占總體積1520左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70條件下，可保存半年至一年。 2）細(xì)胞轉(zhuǎn)化 (1) 取1 l質(zhì)粒DNA加入 100l感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，冰上放置30min， (2) 于42水浴中保溫1min，然后迅速冰

5、上冷卻2min (3) 立即向上述管中分別加入1ml LB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37振蕩培養(yǎng)約45-60min ，使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物(Ampr)（該步驟可以省略）。 3) 平板培養(yǎng) (1) 取各樣品培養(yǎng)液20ul或50ul，涂布于含Amp抗菌素的LB平板培養(yǎng)基上，（用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過后稍微涼一下再用，不要過燙）。 (2) 菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(12-16小時(shí))。 生產(chǎn)DNA 粒質(zhì)旋螺超克微每使可，胞細(xì)態(tài)受感的備制法CaCl2 用5?106-2?107個(gè)轉(zhuǎn)化菌落。在實(shí)際工作中，每微克有105以上的轉(zhuǎn)化菌落足以滿足一

6、般的克隆實(shí)驗(yàn)。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)中使用自制的質(zhì)粒，結(jié)果成 功，觀察到如下圖中所示的培養(yǎng)結(jié)果。 DNA呈藍(lán)色。轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化效率）轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)稀釋（1倍數(shù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積涂板菌 液體積）感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)受體菌對2（照組菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積 涂板菌液體積加入轉(zhuǎn)化子總數(shù)質(zhì)粒DNA質(zhì)粒（轉(zhuǎn)化子數(shù)每gDNA）（3轉(zhuǎn)化頻率g) (量 ）感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率轉(zhuǎn)化子總數(shù)感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)（4 六、實(shí)驗(yàn)討論 應(yīng)設(shè)立對照：1 應(yīng)注意涂板用菌液濃度：2 （每一稀釋度涂布用不同稀釋度菌液進(jìn)行涂板一般應(yīng)對菌液進(jìn)行等比稀釋，二皿），使生長出來的菌落互相獨(dú)立、不混淆，便于挑取單菌落。 的污染防止雜菌和雜DNA3 1）整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行（ 頭等最好是新的，并經(jīng)高壓