第18章-酵母雙雜交系統(tǒng)ppt課件

1、第十八章 用酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,劉新光 ,蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性,蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過(guò)相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。 幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開(kāi)蛋白質(zhì)之間的相互作用,研究蛋白質(zhì)相互作用的常用方法,酵母雙雜交（yeast two hybridization） 親和層析 免疫共沉淀 蛋白質(zhì)交聯(lián) 基于GFP的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究方法 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選,酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過(guò)

2、報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到,第一節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介,它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。 該技術(shù)既可用來(lái)研究哺乳動(dòng)物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來(lái)研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用,一、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立和基本原理,經(jīng)典文獻(xiàn)出處,Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246,一）酵母雙雜交系統(tǒng)的建立,1989年美國(guó)紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交

3、系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)。 該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域,轉(zhuǎn)錄激活因子,DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD) (DNA binding domain,轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD) (activation domain,這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響, 單獨(dú)存在時(shí)沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來(lái)的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能,Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個(gè)氨基酸殘基組

4、成的多肽鏈。 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的DNA-BD由位于N-末端的1147位多肽構(gòu)成，能識(shí)別位于Gal4基因的上游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。 此外，在其N(xiāo)-端還具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768881位多肽構(gòu)成。 當(dāng)Gal4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們?cè)诳臻g上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性,Fields和Song將兩個(gè)融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個(gè)是將Gal4的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個(gè)是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。 其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個(gè)結(jié)合蛋

5、白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的,當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因LacZ的酵母菌株后，通過(guò)SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近, 形成一個(gè)大的復(fù)合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。 Gal4的DNA-BD可識(shí)別位于Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合； Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，激活UAS下游報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄,酵母轉(zhuǎn)錄因子（Gal 4,與BD-fusion -誘餌（bait） 與AD-fusion -獵物或靶蛋白（prey or target protein,報(bào)告基因（reporter ge

6、ne） -Lac Z（編碼-半乳糖苷酶,二）酵母雙雜交系統(tǒng)的原理,酵母雙雜交動(dòng)畫(huà)演示（英文,酵母細(xì)胞作為報(bào)道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有 許多優(yōu)點(diǎn): 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒 具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)告基因 酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來(lái)源于哺乳動(dòng)物的蛋白相 互結(jié)合,報(bào)道株,經(jīng)改造的、含報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞,基因組中GAL4基因是缺失型的 基因組中引入額外的報(bào)告基因LEU、TRP、 HIS,改造后的酵母細(xì)胞的特點(diǎn),通過(guò)功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落,表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白； 檢驗(yàn)這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報(bào)告基因。 做法：首先構(gòu)建能表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白的表達(dá)載體。

7、該載體中可加入進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)型篩選的基因,二、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略,三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),高敏感性。 原因： 采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，使融合蛋白過(guò)量表達(dá)； 激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動(dòng)子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定； 通過(guò)mRNA使信號(hào)放大； 檢測(cè)的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時(shí)的相互作用,三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),高敏感性。 真實(shí)性。檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無(wú)需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。 簡(jiǎn)潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 廣泛性。采用不同組

8、織器官細(xì)胞類(lèi)型和分化時(shí)期的材料構(gòu)建cDNA文庫(kù)，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白,分析已知蛋白之間的相互作用 對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變?cè)龠M(jìn)行雙雜交。 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。 分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)，再根據(jù)篩的已知基因推測(cè)新基因功能。 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜 在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用,四、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀,利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì) 的新功能,將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白

9、，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫(kù)載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系,利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可研究抗原和抗體之間的相互作用，但它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè),利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和 抗體的相互作用,利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及 藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響,對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白相互作用可采取藥物

10、干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的,利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖 （Genome Protein Linkage Map,基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過(guò)基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。 利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫(kù)中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對(duì)于認(rèn)識(shí)一些重要的生命活動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義,五、酵母雙雜交系統(tǒng)中常見(jiàn)問(wèn)題的解決和改進(jìn)措施,一） 假陽(yáng)性較多,二） 轉(zhuǎn)化效率偏低,三） 陰性干擾,假陽(yáng)性定義 在待研究的兩個(gè)蛋白間沒(méi)有發(fā)生相互作

11、用的情況下，報(bào)告基因仍被激活,一） 假陽(yáng)性較多,BD融合誘餌蛋白的單獨(dú)激活作用。這種融合蛋白的激活作用被外來(lái)蛋白激活。 如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結(jié)合，則可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。 AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報(bào)告基因； AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來(lái)許多假陽(yáng)性,原因,排除假陽(yáng)性的措施,作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。 采用多個(gè)報(bào)告基因，且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。目前試劑公司已采用。 報(bào)告基因整合到染色體上，可使基因表達(dá)水平穩(wěn)定。 優(yōu)化3-AT(3-aminotriazole)濃度。適當(dāng)

12、增加濃度可減少假陽(yáng)性。 進(jìn)一步分析： 這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生。 有些蛋白依賴(lài)于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。 一些實(shí)際沒(méi)有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用,酵母轉(zhuǎn)化效率較細(xì)菌低4個(gè)數(shù)量級(jí)，轉(zhuǎn)化成為雙雜交技術(shù)的瓶頸。 辦法：引進(jìn)酵母接合型 a接合型和接合型（兩者之間可，但自身不能形成二倍體,二） 轉(zhuǎn)化效率偏低,接合型酵母細(xì)胞,cDNA文庫(kù),誘鉺蛋白基因,多克隆位點(diǎn),DNA-BD 載體,AD 載體,轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化,a接合型酵母細(xì)胞,篩選平板生長(zhǎng)菌苔,篩選平板生長(zhǎng)菌苔,同一個(gè)三重篩選平板,克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用,鑒定,半乳糖苷酶,部分已商品化,

13、三）陰性干擾,融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性，該怎么辦？ 應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體 蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。 蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達(dá)，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核,兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái),原因,酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法， 有多方面的應(yīng)用， 但仍存在一些局限性,六、酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項(xiàng),酵母雙雜交系統(tǒng)局限性,某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。 -雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域 某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。在細(xì)胞表面

14、發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴(lài)于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無(wú)法進(jìn)行,酵母雙雜交系統(tǒng)局限性,有時(shí)DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，或破壞了融合蛋白的正確折疊。 4. 哺乳動(dòng)物蛋白之間相互作用有時(shí)要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細(xì)胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究 陽(yáng)性克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽(yáng)性結(jié)果一定要通過(guò)其它的實(shí)驗(yàn)手段來(lái)驗(yàn)證,在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展： 酵母單雜交-用于核酸和文

15、庫(kù)蛋白之間的研究 酵母三雜交-三種不同蛋白之間的互作研究 酵母的反向雜交-兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn),七、反向雙雜交系統(tǒng)和三雜交技術(shù),一) 酵母單雜交系統(tǒng)(one-hybrid system,1993年，由Wang和Reed等相繼創(chuàng)立發(fā)展出一種研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)體系,Wang MM, Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature，1993，364(6433):121-126,文獻(xiàn)出處,酵母單

16、雜交系統(tǒng)原理,在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的DNA序列取代DNA Gal4結(jié)合位點(diǎn)。 該DNA序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。 靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gal4 P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過(guò)相互作用可激活作為表型選擇性標(biāo)志的報(bào)告基因的表達(dá),酵母單雜交系統(tǒng)原理,理論上，酵母單雜交系統(tǒng)可利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。 該系統(tǒng)不僅適用于識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和DNA復(fù)制過(guò)程的蛋白質(zhì),待篩選的蛋白Y或BD結(jié)構(gòu)域同AD結(jié)構(gòu)域融合，蛋白Y上

17、游序列或BD與待目的DNA序列結(jié)合，導(dǎo)致AD激活了報(bào)告基因表達(dá),酵母單雜交系統(tǒng)應(yīng)用,確定已知DNA-蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。 分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因。 定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列,研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用,二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)（ reverse yeast two-hybrid system,1996年，Vidal等人建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng),Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD. Reverse two-

18、hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320,二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)（ reverse yeast two-hybrid system,該系統(tǒng)是一項(xiàng)鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報(bào)告基因。 在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激活一種毒性標(biāo)志作為報(bào)告基因，對(duì)酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。 在此

19、情況下BD-X/AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。 利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì),反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖,反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖,雙雜交產(chǎn)生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，從而抑制陽(yáng)性篩選標(biāo)志His3的表達(dá)，此時(shí)野生型相互作用使宿主細(xì)胞表現(xiàn)為組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型,反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用,用于篩選缺陷等位基因的研究 在穩(wěn)定、全長(zhǎng)及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾種遺傳學(xué)策略來(lái)篩選作用缺陷性等位基因。 在反式作用解離分子方面的應(yīng)用 在蛋白質(zhì)組研究方面的應(yīng)用 利用反向雙雜交系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的假陽(yáng)性鑒定工作。反向雙

20、雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個(gè)有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想,第一部分,用酵母雙雜交系統(tǒng)從人睪丸cDNA文庫(kù)初步篩選與 CK2相互作用蛋白的候選克隆,1.1 材料 pGBKT7-HCK2 梁景耀構(gòu)建 Human Testis MATCHMARKER cDNA Library Clontech公司 1.2 方法 1.2.1 人睪丸組織cDNA文庫(kù)質(zhì)粒的擴(kuò)增與抽提 (1) cDNA文庫(kù)的滴度測(cè)定 (2) 文庫(kù)擴(kuò)增：根據(jù)滴度和獨(dú)立克隆數(shù)計(jì)算所需文庫(kù) 原始菌液體積及鋪皿個(gè)數(shù)（共涂布110塊LB/Amp 培養(yǎng)基) (3) 收集培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，制備文庫(kù)質(zhì)粒,1 材料與方法,二)反向酵母雙

21、雜交系統(tǒng)（ reverse yeast two-hybrid system,毒性報(bào)告基因包括URA3和CYH2等。 酵母URA3基因產(chǎn)物一方面為合成尿嘧啶所必需，同時(shí)又能催化5-FOA（5-氟乳清酸）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)。 URA3既可作為陰性篩選標(biāo)志(在含有5-FOA的培養(yǎng)基中)、又可作為陽(yáng)性篩選標(biāo)志(在不含5-FOA的培養(yǎng)基中)，因此應(yīng)用得更廣泛,1.2.2 用誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HCK2篩選文庫(kù) (1) 酵母AH109(pGBKT7-HCK2 ）感受態(tài)制備(醋酸鋰法） (2) 文庫(kù)轉(zhuǎn)化（分步轉(zhuǎn)化法) (3) 檢測(cè)文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率 (4) 初步篩選陽(yáng)性候選克隆 轉(zhuǎn)化混合物接種在75塊SD/-His

22、/-Leu/-Trp培養(yǎng)基中 陽(yáng)性克隆重新在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng) -半乳糖苷酶濾膜影印法初步篩選出陽(yáng)性候選克隆的轉(zhuǎn)化株,2 結(jié)果,2.1 文庫(kù)的擴(kuò)增與抽提 文庫(kù)滴度為3.4109 cfu /ml ； 文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率為2.3105 cfu/g ； 共得轉(zhuǎn)化子約1.15107,2.2 -半乳糖苷酶濾膜影印分析法鑒定的真陽(yáng) 性克隆結(jié)果 138個(gè)克隆呈現(xiàn)藍(lán)色，為陽(yáng)性候選克隆,3 討論,酵母株AH109的表型(Ade-，His-，Leu-， Trp- ）及用以篩選的原理,酵母篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性,高嚴(yán)謹(jǐn)性,低嚴(yán)謹(jǐn)性,最低嚴(yán)謹(jǐn)性,第二部分 相互作用蛋白的進(jìn)一步確證、 cDNA

23、序列測(cè)定及其同源性分析,接種在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade的 缺陷培養(yǎng)基中, 生長(zhǎng)5-7天,可以生長(zhǎng)且-半乳糖苷酶陽(yáng)性為真陽(yáng)性克隆,擴(kuò)增純化陽(yáng)性克隆中質(zhì)粒DNA,以T7-Promoter為測(cè)序引物,測(cè)定文庫(kù)中與CK2亞基相互作用蛋白的cDNA序列,用GenBank 軟件包作序列同源性分析，確定相互作用蛋白名稱(chēng),提取酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109以實(shí)現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)粒的分離并與BD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH109以實(shí)現(xiàn)一對(duì)一回復(fù)性雜交,Fig 14 HL-60 cDNA library construction and the two-hybrid screening procedure 圖14 HL

24、-60 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建和酵母雙雜交的篩選過(guò)程,HL-60 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建和酵母雙雜交的篩選過(guò)程,陽(yáng)性候選克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上重新劃線(xiàn)培養(yǎng) 各挑取10個(gè)-半乳糖苷酶陽(yáng)性克隆, 提取質(zhì)粒 PCR擴(kuò)增文庫(kù)質(zhì)粒cDNA插入片段 限制性酶切分析,1 方 法,1.1 陽(yáng)性候選克隆的鑒定與分組 (將第一部分實(shí)驗(yàn)中獲得的124號(hào)陽(yáng)性候選 克隆用于進(jìn)一步分析,1.2 將從代表性酵母克隆中抽提的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109 以實(shí)現(xiàn)文庫(kù)質(zhì)粒的分離,1.3 單一文庫(kù)質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化,1.4 單一文庫(kù)質(zhì)粒自主激活報(bào)告基因的檢測(cè),1.5 相互作用蛋白的進(jìn)一步確證一對(duì)一回復(fù)

25、性雜交,1.6 單一文庫(kù)質(zhì)粒插入片段的cDNA序列測(cè)定,1.7 相互作用蛋白cDNA序列同源性分析,Fig1 Restriction analysis of the PCR products of the frozen strain by Alu Lane114: the restreaked frozen strain 4,6,3,11,22,12,15,10,14,16,17,18,21,23 PCR products/Alu,Fig2 Restriction analysis of the same PCR products of the frozen strain by Hae Lan

26、e114: the restreaked frozen strain 4,6,3,11,22,12,15,10,14,16,17,18,21,23 PCR products/ Hae,Fig 3 8 PCR band types of plasmid extracts of JM109 transformed by yeast plasmid extracts of the restreaked frozen strains Lane 18: PCR product of 4,21,11,12,6,14,17,16 transformed JM109 clones respectively,2

27、.2 酵母質(zhì)粒抽提物轉(zhuǎn)化JM109,Fig 4 -galactosidase assays of AH109 transformed by library plasmids 1: 4#; 2: 6#; 3: 11#; 4: 12#; 5: 14#; 6: 16# ; 7: 17 #； 8: 21#； N: negative control；P:positive control,2.3 單一文庫(kù)質(zhì)粒對(duì)AH109自主激活實(shí)驗(yàn),Fig 5 -galactosidase assays of AH109 co-transformed by library plasmids and pGBKT7-HCK

28、plasmids 1: 4#; 2: 6#; 3: 11#; 4: 12#; 5: 14#; 6: 16# ; 7: 17 #； 8: 21#； N: negative control；P:positive control,2.4 一對(duì)一回復(fù)性雜交實(shí)驗(yàn),2.5 AD/文庫(kù)質(zhì)粒插入片段cDNA序列測(cè)定結(jié)果 及其同源性分析,Fig6 Partial sequence of pACT2-16-1 plasmids,4-1 491 bp 該片段16460 bp與人泛素52氨基酸融合蛋白 cDNA 37481 bp 100%同源,6-1 291 bp 該片段16250 bp與人CK2亞基cDNA 893

29、1127 bp 99%同源,11-1 699 bp 該片段13663 bp與人核酸酶敏感元件結(jié)合蛋白1 cDNA 8391489 bp 100%同源,12-1 543 bp 該片段16514 bp與類(lèi)似人NADH脫氫酶4 cDNA 11741672 bp 99%同源,Results of DNA sequencing and homologous analysis,14-1 263 bp 該片段29234 bp與人核糖體蛋白L37a cDNA 130335 bp 100%同源,16-1 427 bp 該片段16406 bp與人轉(zhuǎn)換蛋白1 cDNA 13403 bp 100%同源,17-1 11

30、20 bp 該片段1181094 bp與人染色體19上的LLNLR- 278H5 克隆 cDNA64405464 bp 99%同源,3 討論,3.1 AD/文庫(kù)質(zhì)粒及其與BD質(zhì)粒的分離,3.2 酵母雙雜交系統(tǒng)的假陽(yáng)性分析,3.3 篩選到的8種相互作用蛋白的功能及其與蛋白激酶 CK2 的關(guān)系,3.3.1 人轉(zhuǎn)換蛋白1的功能及其與蛋白激酶CK2 的關(guān)系 轉(zhuǎn)換蛋白(transition proteins,TPs)，主要有轉(zhuǎn)換蛋白1（TP1） 和轉(zhuǎn)換蛋白2（TP2）兩種類(lèi)型。 在精子細(xì)胞變態(tài)過(guò)程中, 核內(nèi)堿性蛋白質(zhì)經(jīng)歷了由組蛋白 轉(zhuǎn)換蛋白魚(yú)精蛋白的轉(zhuǎn)換過(guò)程，精子細(xì)胞核由圓形變 為長(zhǎng)形, 核高度濃縮。

31、Tnp1基因缺失鼠的精細(xì)胞染色體以異常的形式濃縮，并且DNA 鏈 斷裂增多，成熟的精子形態(tài)異常，精子活動(dòng)力降低。 本實(shí)驗(yàn)首次觀(guān)察到TP1與CK2間存在的相互作用，對(duì) 研究CK2在精子發(fā)生中的功能及可能機(jī)制有重要意義,3.3.2 核酸酶敏感元件結(jié)合蛋白1的功能及其與蛋白激酶 CK2的關(guān)系 NSEP1是一種細(xì)胞周期特異的轉(zhuǎn)錄因子，還有YB1、YBX1 、 CSDB、 DBPB 等別名 與細(xì)胞增殖有關(guān)，具有調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA剪接及DNA修復(fù)等眾多功能 通過(guò)-干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Jak1/CK2/YB-1途徑)可激活 YB-1核易位 NSEP-1功能眾多，深入研究CK2與NSEP-1之間的

32、關(guān)系，對(duì)了解CK2在精子發(fā)生過(guò)程中的信號(hào)調(diào)節(jié)具有重要意義,3.3.3 泛素52氨基酸融合蛋白的功能及其與蛋白激酶CK2的關(guān)系 泛素主要通過(guò)ATP 依賴(lài)性的泛素-蛋白水解酶復(fù)合體通路途徑高效并高度選擇性地對(duì)蛋白進(jìn)行完全或部分降解 這一途經(jīng)在細(xì)胞內(nèi)許多生理過(guò)程，例如細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分化、應(yīng)激反應(yīng)、離子通道、DNA的修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起著十分重要的作用 CK2是否通過(guò)這一途徑參與眾多的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步探討,3.3.4 核糖體蛋白L37a的功能及其與蛋白激酶 CK2的關(guān)系 核糖體蛋白L37a 是核糖體大亞基中一種重要的蛋白質(zhì)，具有如參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)、正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化

33、及發(fā)育調(diào)控等重要的核糖體外生理功能。 CK2與核糖體蛋白之間的關(guān)系也越來(lái)越成為一個(gè)具有吸引力的課題 ：已報(bào)道核糖體蛋白L22，L5，L41與CK2存在相互作用。本課題組黃功華等也篩選出泛素/核糖體蛋白S27a與CK2亞基發(fā)生相互作用,3.3.5 NADH脫氫酶4的功能及其與蛋白激 酶CK2的關(guān)系 NADH脫氫酶是電子傳遞鏈中最重要的黃素蛋白，其基因的高表達(dá)可改變膜的通透性，可影響線(xiàn)粒體對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。 本實(shí)驗(yàn)表明NADH脫氫酶4與CK2之間存在相互作用，這與CK2的物質(zhì)代謝功能還是與細(xì)胞凋亡的功能有關(guān)還有待進(jìn)一步研究,3.3.6 篩選獲得的其它相互作用蛋白 CK2亞基 17-1#、21-1#

34、文庫(kù)質(zhì)粒上的插入片段經(jīng)序列同源分析，未找到已知蛋白mRNA序列與之相對(duì)應(yīng)，它們的表達(dá)產(chǎn)物可能是新蛋白,第三部分 用GST-pull down 進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)間的相互作用,CK2,Experimental Control (GST-Fusion) (GST,GST,GST,TP1,GST,GST沉降示意圖,1 原理,CK2,CK2,2.2 方法 2.2.1 融合表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-1-TP1構(gòu)建與鑒定,材料與方法2.1 材料 重組人蛋白激酶CK2亞基 陳小文純化并鑒定,pACT2-16-1質(zhì)粒和pGEX-4T-1載體的雙酶切和定向重組,重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌,重組質(zhì)粒的篩選,重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測(cè)序,2.2.2 GST-TP1融合蛋白的原核表達(dá),重組的蛋白激酶CK2亞基,體外表達(dá)獲得的GST-TP1融合蛋白,加入到蛋白結(jié)合 緩沖液中室溫孵育,加入已平衡的谷胱甘肽瓊脂糖珠，室溫孵育,蛋白結(jié)合緩沖液洗滌，除去非特異結(jié)合蛋白,SDS-PAGE分析,同時(shí)設(shè)立GST作為陰性對(duì)照,2.2.3 GST融合蛋白沉降實(shí)驗(yàn),3結(jié)果,3.1重組質(zhì)粒的篩選,Fig 7 The screening of