通冠膠囊對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞向損傷血管內(nèi)膜遷移分化的影響

1、通冠膠囊對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞向損傷血管內(nèi)膜遷移分化的影響,研究背景,骨髓干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞。 如何誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞的分化、遷移、歸巢仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。 已有研究證明多種細(xì)胞因子、藥物等可以促進(jìn)和動(dòng)員骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞分化，進(jìn)而修復(fù)損傷血管內(nèi)膜,研究目的,探討益氣活血類(lèi)中成藥通冠膠囊對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞向損傷血管內(nèi)膜遷移分化的影響。 通冠膠囊組成：丹參、黃芪、水蛭等。廣東省中醫(yī)院制劑，0.5g/粒,處方來(lái)源,通冠膠囊根據(jù)方劑配伍規(guī)律結(jié)合中藥藥理研究擬方而成，得到鄧鐵濤教授的首肯，認(rèn)為組方嚴(yán)謹(jǐn)，藥簡(jiǎn)力宏，君臣佐使，配伍得當(dāng),研究方法,Wistar大鼠30只（180-220g），10

2、只為干細(xì)胞供體，余20只納入實(shí)驗(yàn)，治療組、對(duì)照組各10只，1周后，予頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。 頸動(dòng)脈損傷后24小時(shí)內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射經(jīng)PKH26標(biāo)記的骨髓單個(gè)核細(xì)胞5106個(gè)/只。治療組通冠膠囊（600mg/kg/d）灌胃，對(duì)照組等量的生理鹽水灌胃，4周,PKH26的特性,PKH26是一種親脂性的熒光染料，它可以與細(xì)胞膜不可逆地結(jié)合，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。 在551nm激發(fā)光的作用下可發(fā)出波長(zhǎng)為567nm的紅色熒光。在適當(dāng)?shù)臉?biāo)記后，不影響細(xì)胞的活力。 隨著細(xì)胞的分裂，標(biāo)記物等份地分配到兩個(gè)子細(xì)胞。用PKH26標(biāo)記紅細(xì)胞在體內(nèi)半衰期可達(dá)100d。 根據(jù)這些性質(zhì)PKH26被廣泛用于細(xì)胞的標(biāo)記、示蹤,30只Wis

3、tar大鼠，10只為供體，20只為受體 普通飲食一周后，20只受體大鼠行頸動(dòng)脈損傷,取供體大鼠骨髓制成單個(gè)核細(xì)胞懸液并PKH26標(biāo)記，0.2ml/只由受體大鼠尾靜脈注入,通冠膠囊組,生理鹽水組,4周后處死大鼠，提取標(biāo)本，冰凍切片,免疫熒光組織學(xué)檢測(cè),ELISA檢測(cè)VEGF、SDF-1,收集數(shù)據(jù)，錄入數(shù)據(jù)庫(kù)，分析數(shù)據(jù),技術(shù)路線,檢測(cè)血管內(nèi)膜/膜厚度,隨機(jī),頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型,大鼠用10%水合氯醛麻醉后，頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及其分叉處，從分叉處向近心端游離頸總動(dòng)脈約2 cm，用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈。然后頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端掛線結(jié)扎，用眼科剪在結(jié)扎處附近剪一個(gè)“V”形口，從右頸外動(dòng)

4、脈向頸總動(dòng)脈插入1.5F的球囊導(dǎo)管約1.5 cm，然后向?qū)Ч軆?nèi)注入20ml空氣，拉脫3次即可，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，松開(kāi)動(dòng)脈夾后逐層縫合肌肉及皮膚,頸動(dòng)脈三叉,導(dǎo)絲進(jìn)入,球囊擴(kuò)張拉傷,損傷圖解,V Lindner. Mouse model of arterial injury.Circulation,大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的提取方法,無(wú)菌條件下取大鼠的股骨，紗布剝離骨頭表面的肌肉及組織，骨骺端鉆孔。 5ml注射器抽取5ml的PBS液，由股骨的骨骺端沖出骨髓血，連沖3次，離心，棄上清，3ml的1640重懸。 將含有骨髓血的1640液，1：1平鋪于大鼠淋巴細(xì)胞分離液上（天津津脈），水平離心，2000r/

5、min，15min。 吸取白膜層（第3層）于離心管內(nèi)，加入4mlPBS液，1500r/min，5min，洗3遍,PKH26染骨髓單核細(xì)胞的方法,加入lm l Diluent C重懸細(xì)胞，輕輕吹打細(xì)胞。 染色之前即刻，在含有1mlDiluent離心管中配制410 mol/L（4l）的PKH26染料。 迅速均勻地將1ml的細(xì)胞液和含有1mlDiluent的染料液相混合，輕輕吹打、混勻。 25孵育25 min，不時(shí)吹打混勻。 加入等量的血清（2ml）終止反應(yīng)， 放置1min。加入等量的完全培養(yǎng)液稀釋。 1500r/min,5min. 棄上清。無(wú)血清培養(yǎng)液3ml重懸細(xì)胞,大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的提取,單核

6、細(xì)胞 100,PKH26染后的單核細(xì)胞,單核細(xì)胞層（白膜層,實(shí)驗(yàn)結(jié)果1,血管內(nèi)膜再內(nèi)皮化的面積：頸動(dòng)脈損傷后3天、1周、2周，1的Evans blue 2ml經(jīng)尾靜脈注射，生理鹽水灌流5分鐘后，取出損傷部位的頸總動(dòng)脈長(zhǎng)約1cm，血管縱向切開(kāi)，平鋪固定,損傷后3天,損傷后1周,損傷后3周,實(shí)驗(yàn)結(jié)果2,計(jì)算血管內(nèi)膜中膜厚度：3周后將兩組大鼠的損傷頸總動(dòng)脈冰凍切片，行HE和彈力纖維染色，光鏡下，圖像分析，計(jì)算兩組的內(nèi)膜、中膜厚度和比值,通冠膠囊組,鹽水組,頸動(dòng)脈橫切HE染色50,通冠膠囊組,鹽水組,頸動(dòng)脈彈力纖維染色50,通冠膠囊對(duì)球囊損傷后內(nèi)膜增殖影響,對(duì)照組內(nèi)膜50,治療組內(nèi)膜 50,治療組內(nèi)膜

7、面積和內(nèi)膜/中層面積比值均低于對(duì)照組（P0.05）。提示通冠膠囊具有抑制球囊損傷后血管內(nèi)膜增殖的作用,張敏州，等.通冠膠囊對(duì)兔球囊血管成形術(shù)后血管病理形態(tài)的影響，中國(guó)中醫(yī)急癥，2006,實(shí)驗(yàn)結(jié)果3,觀察PKH26標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞在損傷動(dòng)脈內(nèi)膜處的表達(dá)：取頸總動(dòng)脈冰凍切片，室溫下避光1h，中性樹(shù)膠封片，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)紅色熒光和綠色熒光的血管內(nèi)膜,鹽水組50,PKH26,FITC-VEGFR-2,通冠膠囊組50,實(shí)驗(yàn)結(jié)果4,藥物干預(yù)后，ELISA法檢測(cè)兩組大鼠血清中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的濃度，探討通冠膠囊動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞的分子機(jī)制,VEGF濃度

8、（pg/ml,SDF-1濃度（pg/ml,2周、3周后通冠膠囊組VEGF和SDF-1濃度均較對(duì)照組有明顯升高（P0.05,討 論,骨髓干細(xì)胞與內(nèi)皮祖細(xì)胞,生理作用：骨髓單個(gè)核細(xì)胞含有造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等細(xì)胞成分，其均為單細(xì)胞組成，故稱(chēng)為骨髓單個(gè)核細(xì)胞,具有多向分化潛能。 損傷修復(fù)：EPCs具有高度分化和增殖潛能，在特定的生長(zhǎng)條件下可分化為EC，在損傷血管修復(fù)中的作用至關(guān)重要，所以EPCs是內(nèi)皮完整性得以維持的決定性因素。當(dāng)EC受到損傷或發(fā)生凋亡時(shí)，EPCs作為內(nèi)皮補(bǔ)片添補(bǔ)壞死細(xì)胞造成的空缺,長(zhǎng)期和反復(fù)暴露于心血管危險(xiǎn)因素最終耗盡內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)的保護(hù)效應(yīng),不但造成內(nèi)

9、皮功能異常而且使內(nèi)皮細(xì)胞失去完整性,造成細(xì)胞衰老脫離循環(huán),反映內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞膜（內(nèi)皮微粒）脫離,隨著年齡增長(zhǎng)和ROS持續(xù)發(fā)信號(hào)，臨近內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷內(nèi)皮的修復(fù)能力有限使得維持血管完整性依賴(lài)于EPC參與,體育鍛煉、雌激素 、PHA、他汀、 G-CSF SDF-1 VEGF PDGF、EPO、HGF、Ang-I、 SCF、FGF、PGF,凋亡體、細(xì)胞與細(xì)胞 接觸、黏附分子,VEGF、SDF-1,EPC的動(dòng)員、歸巢和分化除受到各自獨(dú)立的因素調(diào)控外，還可受到多種共同因素的調(diào)控。VEGF和SDF-1既可促進(jìn)EPC動(dòng)員，又可促使其歸巢,對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員歸巢分化作用的因素,I型PI3K（IA和IB），IA

10、 型PI3K（p110和p85），PI3K通過(guò)兩種方式激活, 一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長(zhǎng)因子受體或連接蛋白相互作用, 引起二聚體構(gòu)象改變而被激活; 另一種是通過(guò)Ras和p110直接結(jié)合導(dǎo)致PI3K的活化。PI3K激活產(chǎn)生第二信使PIP3, PIP3與Akt和PDK1結(jié)合, 促使Akt的活化。Akt還能通過(guò)PDK2而被激活?；罨腁kt通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-B、GSK-3、FKHR 、p21Cip1和p27 Kip1等, 進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等,后期研究,EPCs的分離、培養(yǎng),1010,EPCs染色與鑒定,通冠膠囊對(duì)EPCs

11、周期的影響,24h,48h,組別,Con,Simv,TGC,Wortmannin,5.420.56,7.010.65 a b,14.720.21a c,2.870.63,3.760.21,14.720.21a b,2.050.07,a 與con相比 P0.01,b 與 WT相比 P0.01,c TGC24h與 simv24h相比 P0.01,18.72.720.23,通冠膠囊對(duì)EPCs的遷移影響,通冠膠囊對(duì)EPCs的遷移影響,2010,通冠膠囊對(duì)EPCs的粘附作用,組別,con,Simv,TGC,Wortmannin,24h,48h,26.661.32,30.662.29a b,31.442.

12、69a b,25.111.96,20.662.44,31.223.86a b,30.771.64a b,19.771.56,a 與con相比 P0.01,b 與 WT相比 P0.01,正在進(jìn)行實(shí)驗(yàn),Western blotting檢測(cè)Akt、VEGF、eNOS蛋白的表達(dá)，以探討通冠膠囊動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)損傷內(nèi)皮的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路,通冠膠囊的前期研究基礎(chǔ),張敏州，李松，鄒旭，等.通冠膠囊對(duì)冠心病介入術(shù)后血脂含量和凝血功能的影響.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào).2004.21(2)：93-97. 張翔煒，張敏州，李松，等.通冠膠囊對(duì)冠心病介入術(shù)后凝血、纖溶系統(tǒng)的影響.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志.2004.24(12）：1065-1068. 林曉忠，程康林，鄒旭，等.通冠膠囊對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后膠原表達(dá)及血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.新中醫(yī)。2007.39（11）：101-103. 趙新軍，張敏州.通冠膠囊對(duì)高脂大鼠血脂水平和血漿炎癥因子的影響.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志. 2007.5（10）：951