免疫沉淀與免疫共沉淀原理及方法

1、免疫沉淀與免疫共沉淀原理及方法一、基本概念免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來，初步分離靶蛋白的一種方法。免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一種在體外探測兩個蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理是如果兩個蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話，那么當(dāng)用一種蛋白的抗體進行免疫沉淀時，另一個蛋白也會被同時沉淀下來。與酵母雙雜交技術(shù)不同，免疫共沉淀技術(shù)所利用的是抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，是一種基于體外非細胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的方法。不難看出，免疫共沉淀與免疫

2、沉淀技術(shù)所使用的原理與方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，對靶蛋白的結(jié)合與沉淀由另一個與之發(fā)生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基礎(chǔ)上，通過進一步與其它技術(shù)的結(jié)合，如聚丙烯酰胺凝膠電泳，還可進一步對靶蛋白的的分子量等特性進行鑒定。二、抗體的選擇（一）多克隆抗體 多克隆抗體因其制備相對簡單，可與靶蛋白分子的多個位點結(jié)合，所形成的抗原抗體復(fù)合物較穩(wěn)定因而應(yīng)用的最為廣泛。但多克隆抗體的缺點在于非特異性結(jié)合較多，常會導(dǎo)致反映本底（是否是背景）升高和一定的假陽性結(jié)果。（二）單克隆抗體與多克隆抗體相比，單克隆抗體往往只結(jié)合一種抗原表位，具有單一結(jié)合特異性，所以發(fā)生非特異結(jié)合的機會少，可被用

3、于確定靶蛋白上某一部位的特殊結(jié)構(gòu)，甚至可被用于區(qū)分相同靶蛋白的不同形式如構(gòu)象變化和修飾。但反過來，單克隆抗體僅與單一表位結(jié)合的特性也會引起具有同一表位的不同靶蛋白間的交叉反應(yīng)。三、免疫沉淀方法免疫沉淀的靶蛋白一般來自細胞裂解液，可以是被同位素標記的也可以是未被標記的。若為前者，免疫沉淀后再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，只需壓片即可檢測到靶蛋白的存在；若為后者，經(jīng)免疫沉淀和聚丙烯酰凝膠電泳后，尚需借助銀染或免疫印跡進行鑒定。（一）所需試劑及溶液改良的RIPA液（細胞裂解液）、稀釋緩沖液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2SDS蛋白上樣緩沖液、抗體與Sepharos

4、e或抗免疫球蛋白抗體、蛋白A、蛋白G的交聯(lián)物。改良的RIPA液的組成（100ml體系）：Tris-HCl: 50 mM（pH 7.4）、NP-40: 1%脫氧膽酸鈉（0.25%）、NaCl（150 mM）、EDTA（1 mM）、PMSF（1 mM）、抑肽酶、亮肽酶素、抑肽素（各1g /ml）、Na3VO4（1 mM）、NaF（1 mM）。（二）方法1用冰冷的PBS溶液洗滌貼壁細胞兩次，棄干凈PBS。（對于懸浮細胞則用臺式離心機以800-1000rpm轉(zhuǎn)速通過離心洗滌）。2給細胞培養(yǎng)瓶中加入冰冷的改良RIPA液，RIPA液的用量：按照1 ml/107 細胞/100mm 培養(yǎng)面/150cm2瓶或

5、0.5 ml每5106 細胞/60mm 培養(yǎng)面/75cm2 瓶計算。3用經(jīng)蒸餾水預(yù)冷的橡皮或塑料細胞刮棒將貼壁細胞轉(zhuǎn)移至一離心管中，輕輕混勻細胞懸液，用振蕩器在4振蕩15min以裂解細胞。4于4，14000g離心裂解液15min，迅速轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中，棄掉沉淀。5準備蛋白A（蛋白G或Sepharose）：用PBS洗滌蛋白A（蛋白G或Sepharose）珠子兩次，并將其用PBS調(diào)制成50懸液。6每1ml細胞裂解液上清加入100l蛋白A，4，振蕩10min，進行預(yù)清除。74，14000g離心10min移去蛋白A（蛋白G或Sepharose）珠子，轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中。8用Bradford法

6、（考馬斯亮藍染色法）測定蛋白濃度。（應(yīng)至少將細胞裂解液作1：10稀釋后再測定，這是因為存在于裂解液中的去污劑成分會干擾考馬斯亮藍的作用）。9根據(jù)所測得的細胞裂解液蛋白濃度，用PBS將其稀釋至1mg/ml以降低緩沖體系中去污劑的濃度（但對于那些在細胞中表達水平較低的蛋白而言，10mg/ml這樣更高的濃度可能對免疫沉淀更有效一些）。10加入推薦體積的免疫沉淀抗體至500l細胞裂解液中。（抗體的最適用量要根據(jù)每一細胞模型中免疫沉淀靶蛋白的數(shù)量來確定）。11將細胞裂解液與抗體輕輕混勻后孵育2h，或置搖床上振蕩4過夜。（選擇孵育2h常用于免疫沉淀與激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。）加入100l蛋白A（蛋白G或Sepharose）輕輕振蕩1h或4過夜以捕獲免疫沉淀復(fù)合物。（在多數(shù)情況下，加入2g像兔抗小鼠IgG這樣的橋連抗體可以增強對免疫復(fù)合物的捕獲能力，這對于像小鼠IgG1或由雞所產(chǎn)生的低親和力抗體尤為重要）。12通過脈沖離心（14000 rpm，5s）收集瓊脂糖/Sepharose珠子，棄掉上清，用800l冰冷的改良RIPA緩沖液洗滌