對(duì)體外培養(yǎng)的髁狀突軟骨細(xì)胞施加張應(yīng)力觀察其生長(zhǎng)

1、對(duì)體外培養(yǎng)的髁狀突軟骨細(xì)胞施加張應(yīng)力觀察其生長(zhǎng)引言 Introduction功能矯形治療是口腔正畸學(xué)中矯治患者下頜發(fā)育不足、后縮畸形的主要方法。顳下頜關(guān)節(jié)是人體關(guān)節(jié)中能保持終生改建的惟一關(guān)節(jié)，而髁狀突軟骨作為下頜骨的主要生長(zhǎng)中心，對(duì)矯形力的反應(yīng)直接而又敏感，是臨床功能矯形治療的主要功能區(qū)域，同時(shí)也是功能矯正器治療下頜后縮畸形的生物學(xué)理論基礎(chǔ)。多種因素可以誘發(fā)髁突改建如創(chuàng)傷、增齡性變化、顳下頜關(guān)節(jié)盤(pán)移位等，同時(shí)也是功能矯正器治療下頜后縮畸形的生物學(xué)理論基礎(chǔ)。是在使用功能矯正器對(duì)下頜后縮畸形的臨床矯正中，下頜向前移位，牽拉顳下頜關(guān)節(jié)韌帶，將應(yīng)力作用于顳下頜關(guān)節(jié)，髁突軟骨在所承受之力的不斷作用下，發(fā)

2、生相應(yīng)的改建，髁狀突在功能矯形下獲得的垂直方向和水平方向的生長(zhǎng)對(duì)于下頜后縮的改善起到有效而且持久的作用。Chen等研究中改變應(yīng)力加載模式能對(duì)髁狀突軟骨產(chǎn)生不同的生長(zhǎng)刺激，髁狀突軟骨內(nèi)各種生長(zhǎng)因子水平發(fā)生不同變化。Ng等研究中，重復(fù)的機(jī)械力刺激可以增加髁狀突軟骨中Ihh因子表達(dá)，而Ihh信號(hào)傳導(dǎo)通路在軟骨骨化成熟過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。但是由于在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，細(xì)胞力學(xué)的功能研究因其所處生理環(huán)境的復(fù)雜性、刺激因素傳導(dǎo)的不定向性，應(yīng)力刺激對(duì)髁狀突軟骨細(xì)胞的直接影響需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。髁狀突軟骨細(xì)胞是下頜骨生長(zhǎng)、髁狀突改建及創(chuàng)傷后修復(fù)的主要細(xì)胞，功能負(fù)荷改變誘導(dǎo)組織中的間充質(zhì)細(xì)胞增殖并分化為成軟骨細(xì)胞，

3、再繼續(xù)分化為成熟的軟骨細(xì)胞，形成軟骨組織。髁突軟骨通過(guò)自分泌和旁分泌形式產(chǎn)生的細(xì)胞因子，形成復(fù)雜的代謝調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)，各種細(xì)胞因子之間相互拮抗或協(xié)同作用，調(diào)節(jié)酶及其抑制劑的活性，共同對(duì)軟骨的代謝進(jìn)行調(diào)控。在促進(jìn)髁突軟骨生長(zhǎng)改進(jìn)的應(yīng)力作用下，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和基質(zhì)形成的細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)；在異常應(yīng)力的作用下，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)基質(zhì)降解的細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)。正畸治療下頜后縮畸形中，功能矯治器通對(duì)髁突施加一定的張應(yīng)力刺激，引導(dǎo)其相應(yīng)的生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)下頜髁突生長(zhǎng)來(lái)矯治下頜骨發(fā)育不足。為了對(duì)髁狀突軟骨細(xì)胞在張應(yīng)力下的反應(yīng)做進(jìn)一步探討，文章采用應(yīng)力加載裝置對(duì)體外培養(yǎng)的髁狀突軟骨細(xì)胞施加一定的張應(yīng)力，分析其生長(zhǎng)改變，進(jìn)

4、一步闡述功能性矯正器對(duì)于下頜后縮的病例的矯正機(jī)制。1 材料和方法 Materials and methods設(shè)計(jì)：細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn)：于2012年1月至2013年12月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。材料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康2周齡新西蘭白兔1只，雌雄不限，購(gòu) 自 山 東 魯 抗 醫(yī) 療 公 司 ， 動(dòng) 物 許 可 證 號(hào) ： slxk-lu-20100109 。 實(shí) 驗(yàn) 過(guò) 程 中 對(duì) 動(dòng) 物 的 處 置 符 合 2009 年Ethical issues in animal experimentation相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。實(shí)驗(yàn)設(shè)備：多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)由通訊作者袁曉博士與哈

5、爾濱工業(yè)大學(xué)共同研制，應(yīng)用Flexcell公司生產(chǎn)的BF-300lU BioFlex彈性膜6孔培養(yǎng)板作為細(xì)胞培養(yǎng)單元，動(dòng)力加載單元使用VCA5038B型微型真空泵，并采用C8051f410單片機(jī)作為控制核心，通過(guò)編制相應(yīng)的單片機(jī)程序，從而實(shí)現(xiàn)多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力的檢測(cè)與控制，根據(jù)對(duì)多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力控制實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)要求，系統(tǒng)壓檢測(cè)范圍：0-25 kPa；可以提供0-20%的形變率，應(yīng)變頻率在0-0.5 Hz內(nèi)可調(diào)。方法：細(xì)胞培養(yǎng)：選取2周新西蘭白兔，麻醉后局部消毒取髁狀突軟骨，用PBS充分漂洗3次，將軟骨用手術(shù)剪剪至1 mm3大小，PBS沖洗2次。加0.25%胰蛋白酶大約3 mL至培養(yǎng)板中消化

6、軟骨組織，5-10 min震蕩混勾1次，消化30 min后加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，離心5 min(1 000 r/min)，將上清液吸去之后再向其中加入0.2%型膠原酶約2 mL，用移液管將沉淀吹散，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化60 min，離心5 min(1 000 r/min)，得到沉降細(xì)胞，然后將含體積分?jǐn)?shù)10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基加入管里后吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105，在新的培養(yǎng)皿中開(kāi)始培養(yǎng)。置于37 恒溫，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。對(duì)通過(guò)以上培養(yǎng)技術(shù)得到的髁狀突軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外鑒定(甲苯胺藍(lán)染色)，并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線描記、計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間等對(duì)

7、所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。應(yīng)力加載裝置：多通道細(xì)胞應(yīng)力加載裝置采用1個(gè)真空泵抽吸由特制彈性硅膠膜制成的培養(yǎng)皿底部，形成負(fù)壓使培養(yǎng)皿底部產(chǎn)生拉伸變形，從而使附底生長(zhǎng)的細(xì)胞受機(jī)械牽張，細(xì)胞所受力值大小以培養(yǎng)皿底部硅膠膜拉伸形變率(%)表示，形變率越大，表示細(xì)胞所受張力越大。周期性張應(yīng)力加載：在細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108L-1，并使之同步化生長(zhǎng)后轉(zhuǎn)移至6孔BioFlex 特制細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)48 h待用。將待測(cè)細(xì)胞置于多通道細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)內(nèi)，施加10%形變率、6循環(huán)/min的周期性張應(yīng)力，每一循環(huán)包括3 s拉伸/3 s松弛；設(shè)置相應(yīng)的不加力對(duì)照組。分別在0，

8、1，6，12和24 h時(shí)收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定髁狀突軟骨細(xì)胞增殖活性的變化：加載應(yīng)力完畢后，立刻收集髁狀突軟骨細(xì)胞于15 mL離心管中，同時(shí)收集相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞。置于離心機(jī)內(nèi)1 000 r/min離心5 min，棄上清，然后加入預(yù)冷的PBS 5 mL，反復(fù)吹打，再以1 000 r/min 離心5 min，棄上清，反復(fù)沖洗3次，用4 體積分?jǐn)?shù)75%乙醇2 mL固定髁狀突軟骨細(xì)胞，將制備好的髁狀突軟骨細(xì)胞懸液置于4 冰箱過(guò)夜。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)前，將固定好的細(xì)胞懸液，以1 500 r /min 離心5 min，棄上清，加入DNA-Prep LPR固定液100 μL，混勻10

9、 s，再加入DNA-Prep Stain染料1 mL，混勻后室溫避光15 min，上機(jī)檢測(cè)S期細(xì)胞比率。MTT法檢測(cè)應(yīng)力加載對(duì)髁狀突軟骨細(xì)胞增殖的影響：在收集細(xì)胞前4 h每孔加入5 g/L的MTT 200 μL，各組取5孔細(xì)胞。加力結(jié)束時(shí)，吸除各孔內(nèi)液體，每孔再加入DMSO1.5 mL，搖床振蕩至染色顆粒完全溶解，使用加樣槍吸取液體至96孔板，每孔200 μL，以不含細(xì)胞的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液作為空白調(diào)零孔，上全自動(dòng)酶標(biāo)儀，492 nm測(cè)定吸光度值(A)。主要觀察指標(biāo)：檢測(cè)S期細(xì)胞比率和髁狀突軟骨細(xì)胞增殖A值，定量檢測(cè)加載應(yīng)力后細(xì)胞出現(xiàn)的變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本文作者應(yīng)用SP

10、SS 10.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的S期細(xì)胞比率和A值數(shù)據(jù)進(jìn)行采用單因素方差分析，計(jì)量資料以x_±s表示，P2 結(jié)果 Results2.1 兔髁狀突軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài) 原代培養(yǎng)的髁狀突軟骨細(xì)胞24 h內(nèi)可完全貼壁，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，三角形、多角形均存在。原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞7 d可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底，形成單層，軟骨細(xì)胞在部分區(qū)域簇集成團(tuán)，呈集落樣生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞一般36 h內(nèi)可完全貼壁，一般5 d可形成單層。隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞中梭形細(xì)胞增多，軟骨細(xì)胞分泌和增殖能力下降，傳代周期延長(zhǎng)(圖1A，B)。2.2 兔髁狀突軟骨細(xì)胞的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果 原代培養(yǎng)的髁狀突軟骨細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，甲苯

11、胺藍(lán)染色見(jiàn)單層生長(zhǎng)區(qū)域的細(xì)胞正染成淺藍(lán)色，有二至三個(gè)核仁，核仁呈深藍(lán)色，集落樣生長(zhǎng)和多層生長(zhǎng)區(qū)的中心部位細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)異染成紫紅色，細(xì)胞核正染成深藍(lán)色，而其他邊緣部位異染不及中心區(qū)域(圖1C)。2.3 兔髁狀突軟骨細(xì)胞的透射電鏡觀察結(jié)果 可見(jiàn)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常細(xì)胞核為球形，橢圓形，核形態(tài)不規(guī)則，核仁邊集，常染色質(zhì)明顯，可見(jiàn)核小體，細(xì)胞內(nèi)有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體及分泌小泡(圖2A)。2.4 兔髁狀突軟骨細(xì)胞S期細(xì)胞比率 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，10%形變率、6循環(huán)/min的周期性牽張力加載于細(xì)胞6 h和12 h后，細(xì)胞S期細(xì)胞比率開(kāi)始增加，差異有顯著性意義(P2.5 MTT染色結(jié)果 在10%形

12、變率、頻率6循環(huán)/min的周期性張應(yīng)力作用下，髁狀突軟骨細(xì)胞在加力1，6，12和24 h，與相應(yīng)對(duì)照組比較均有細(xì)胞數(shù)量上的增加，其中加力24 h時(shí)細(xì)胞數(shù)量增加明顯，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(PMTT染色結(jié)果顯示，髁狀突軟骨細(xì)胞內(nèi)形成藍(lán)紫色結(jié)晶，加力1，6和12 h組細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)紫色顆粒狀物，結(jié)晶物較少；加力組在24 h時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)大量松枝狀的藍(lán)紫色結(jié)晶物，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)(圖2B，C)。3 討論 Discussion在臨床對(duì)下頜后縮病例矯正時(shí)，常采用功能矯正器，如Activator等對(duì)下頜生長(zhǎng)進(jìn)行刺激，促進(jìn)下頜髁狀突軟骨區(qū)增生改建。通過(guò)矯正器持續(xù)的對(duì)下頜施加前伸力，顳下頜關(guān)節(jié)韌帶對(duì)髁

13、狀突軟骨牽張加力，改變軟骨內(nèi)細(xì)胞的受力環(huán)境，通過(guò)一系列細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，促進(jìn)軟骨區(qū)細(xì)胞分化、增生、改建，進(jìn)而形成新的骨組織，促進(jìn)下頜升枝在長(zhǎng)度和高度方向的增加。Pancherz等曾用頭影測(cè)量技術(shù)分析了98例經(jīng)Herbst治療的類患者，經(jīng)六至七個(gè)月的治療，有效的髁狀突生長(zhǎng)為水平向后，增長(zhǎng)量是對(duì)照組的3倍，髁狀突的生長(zhǎng)引起頦部向前旋轉(zhuǎn)，這一改變是對(duì)照組的5倍。Ruf等利用MRI技術(shù)，觀察治療前后髁狀突，關(guān)節(jié)窩的改建過(guò)程，發(fā)現(xiàn)在髁狀突后上區(qū)有一信號(hào)增強(qiáng)的清晰帶，說(shuō)明該區(qū)細(xì)胞增生活躍，有新的軟骨組織形成。Ng、Ma、Thieme等在各自動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)經(jīng)功能矯正器治療的動(dòng)物進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)在髁狀突軟骨中

14、細(xì)胞細(xì)胞各種促生長(zhǎng)因子表達(dá)增加，細(xì)胞分化明顯，增生活躍。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示功能矯正與髁突軟骨增生之間存在一定的作用關(guān)系，但機(jī)械力學(xué)與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控之間的轉(zhuǎn)換機(jī)制仍處于研究之中。將作用力直接加載至細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)變化成為現(xiàn)在研究機(jī)械力學(xué)與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控之間的轉(zhuǎn)換機(jī)制的有效方法。多通道細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)符合體外細(xì)胞應(yīng)力加載的要求，操作方便，性能可靠，可長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定運(yùn)行，已在多種細(xì)胞體外加力實(shí)驗(yàn)中得到應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用多通道細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)模擬髁狀突軟骨細(xì)胞在體內(nèi)受到功能矯正器作用力的狀態(tài)，隨下頜的前伸后退產(chǎn)生加力、松弛的循環(huán)。髁狀突軟骨細(xì)胞通過(guò)對(duì)應(yīng)力的感應(yīng)，激活細(xì)胞復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如Ihh-PTHrP信號(hào)傳導(dǎo)通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)等，使得細(xì)胞代謝活躍，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期的分布狀態(tài)進(jìn)行分析以及應(yīng)用MTT法檢測(cè)活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行定量研究均顯示周期性的張應(yīng)力對(duì)于髁狀突軟骨細(xì)胞增殖具有明顯的促進(jìn)作用，加力組與對(duì)