酶免疫測試EIA技術(shù)

1、酶免疫測試（EIA）技術(shù),酶免疫分析技術(shù)（enzyme immunoassay,EIA）是繼熒光免疫技術(shù)和放射免疫技術(shù)之后建立的一種非放射性免疫技術(shù)，是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合，發(fā)展建立的一種非放射性標(biāo)記的免疫性標(biāo)記分析方法。酶免疫分析系統(tǒng)則屬于開放式的，符合標(biāo)準(zhǔn)的各種品牌的ELISA試劑盒均可應(yīng)用，且有靈敏度高、特異性強(qiáng)、酶免疫試劑的性質(zhì)比較穩(wěn)定、操作方法簡便、快速、無放射性污染以及應(yīng)用范圍廣等很多優(yōu)點(diǎn),酶免疫分析技術(shù),非均相酶免疫分析,均相酶免疫分析,非均相液相酶免疫分析,非均相固相酶免疫分析,以聚苯乙烯制品作為載體的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)-ELISA,一、酶免疫測試（

2、EIA）技術(shù)分類,二、ELISA技術(shù)方法與原理,1）ELISA特點(diǎn)：在固相表面組裝免疫活性物質(zhì)形成免疫吸附劑；酶標(biāo)記免疫活性物質(zhì)，進(jìn)行信號放大；有二步溫育反應(yīng)二次洗滌過程；靈敏度特異性相對較高。 （2）ELISA局限性：只能檢測到ng水平，精密度差（批內(nèi)CV15-20%）；線性范圍窄（一個(gè)數(shù)量級）。 （3）根據(jù)檢測目的和操作步驟不同有三種基本方法：雙抗體（原）夾心法 ；間接法；競爭法,ELISA測試原理,1）將鏈霉親合素包被的聚苯乙烯塑料試管安置固定。 2）將生物素標(biāo)記的特異性抗體和待測抗原加入鏈霉親合素包被小管內(nèi)，經(jīng)溫育，生物素和親和素發(fā)生連接，待測抗原和特異性抗體發(fā)生結(jié)合，形成固相包被親合

3、素-生物素-特異性抗體-待測抗原復(fù)合物，然后進(jìn)行洗滌，除去未結(jié)合的抗原和生物素標(biāo)記抗體。 3）加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的特異性抗體(酶標(biāo)抗體)，經(jīng)溫育形成固相包被鏈酶親合素-生物素-特異性抗體-待測抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，再次進(jìn)行洗滌，除去多余的酶標(biāo)抗體。 4）加入底物ABTS和H2O2，經(jīng)溫育，ABTS在辣根過氧化物酶的作用下顯色，然后經(jīng)波長450nm的光度計(jì)測定獲得A值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測抗原的含量,光源 光路 微孔板 觸摸屏電源 單 A/D轉(zhuǎn)換 程控放大器 多路開關(guān) 光電檢測 顯示器 片 打印機(jī) 步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng) 步進(jìn)電機(jī) 送樣機(jī)構(gòu) 電源 機(jī) 圖2 工作原理方框圖,電源,四、ELI

4、SA操作步,1）試劑的準(zhǔn)備 （2）加樣 （3）保溫 使用恒溫水箱 使用保溫箱 （4）洗滌 （5）比色,五、ELISA質(zhì)量控制 （一）的測試前標(biāo)本的采集和保存,1）可作標(biāo)本廣泛，體液（如血清，血漿，各種積液），分泌物（如唾液）和排瀉物（如糞便，尿液）均可。 （2）標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)盡量避免溶血，否則造成假陽性；長菌的標(biāo)本同樣的道理易產(chǎn)生假陽性。 （3）抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑。 （4）標(biāo)本保存：血清置4冰箱5天內(nèi)完成測試；一周以上則要-20冰凍保存，融解時(shí)應(yīng)上下顛倒充分混勻。 （5）ELISA的靈敏度1ng/ml水平上,標(biāo)本間的污染要盡量避免

5、，尤其不應(yīng)與生化試驗(yàn)用同一管標(biāo)本，最起碼應(yīng)先做免疫后做生化,二）儀器質(zhì)控,1）移液器：ELISA加樣量?。?-100l），其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法檢查，一般應(yīng)在10%以內(nèi)； （2）水浴箱：經(jīng)常檢查水浴箱溫度計(jì)所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實(shí)測溫度是否一致，允許有1的誤差； （3）洗板機(jī)：每個(gè)廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul，人工扣板時(shí)，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞； （4）酶標(biāo)儀：經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能,三）分析中質(zhì)控,1）加樣 （2）溫育 （3）洗滌 （4）顯色 （5）酶標(biāo)儀判讀結(jié)果,六、ELISA操作注意事項(xiàng),

6、1）測試之前，冰箱內(nèi)試劑一定要復(fù)溫（至室溫），并檢查是否已經(jīng)變質(zhì)，同時(shí)用雙蒸水稀釋濃縮的洗滌液和稀釋液，若用不合格的蒸餾水則可使空白值增高。 （2）微量加液器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正，否則結(jié)果誤差較大，同時(shí)加樣時(shí)不可出現(xiàn)氣泡，以免反應(yīng)物間不能充分混勻反應(yīng)。 （3）溫育時(shí)要力求受熱均勻，同時(shí)避免液體蒸發(fā)。 （4）洗滌時(shí)力求次數(shù)足夠，且避免形成氣泡，否則洗滌不完全。 （5）比色時(shí)反應(yīng)管內(nèi)不能留有氣泡，管底不能存有水滴，否則出現(xiàn)較大誤差,七、影響ELLSA測試結(jié)果常見問題原因及解決方法,1.選擇試劑 2.加樣 3.孵育 4.洗板 5.顯色 6.終止 7.讀板,八、RT-2100C型多功能酶標(biāo)儀儀器特點(diǎn),

7、1、RT-2100C可廣泛應(yīng)用于傳染病、腫瘤標(biāo)志物、血液病、艾滋病、內(nèi)分泌障礙測定等臨床論斷領(lǐng)域。 2、大屏幕漢化界面，利用觸摸屏和筆作為輸入方式，極大地方便了用戶的操作輸入。 3 、100個(gè)可編程的檢驗(yàn)項(xiàng)目。 4、多種定量、定性計(jì)算方法 5、96孔可視化布板，空白位、對照位、樣本位、標(biāo)準(zhǔn)品位任意設(shè)置，同一板上可同時(shí)進(jìn)行最多12個(gè)項(xiàng)目的測試。 6、8通道檢測迅速準(zhǔn)確(5秒/板)，測試前的震動(dòng)混勻功能,7、大容量歷史數(shù)據(jù)保存，最多可保存500個(gè)項(xiàng)目，1000個(gè)病人，10000條樣本記錄。 8、形式多樣的綜合中文報(bào)告輸出，支持多種品牌系列的外置打印機(jī)。 9、強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)功能：可與醫(yī)院內(nèi)部計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)、

8、質(zhì)量監(jiān)測中心及雷杜用戶服務(wù)中心聯(lián)網(wǎng)，為工作帶來極大的便捷。 10、配合使用雷杜酶標(biāo)實(shí)驗(yàn)室管理系統(tǒng)，可以在聯(lián)網(wǎng)計(jì)算機(jī)上進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和分析。 11、輔助管理功能：內(nèi)置科室數(shù)據(jù)庫、醫(yī)生數(shù)據(jù)庫和系統(tǒng)日志數(shù)據(jù)庫,九、RT-2100C型多功能酶標(biāo)儀常用測試項(xiàng)目,1）肝炎類：甲肝抗體IgM、乙肝兩對半、丙、丁、戊、庚性肝炎抗體等 （2）傳染病類：愛滋病、衣原體、肺炎支原體、腺病毒、幽門螺旋桿菌、腮腺炎、麻疹、水痘、百日咳桿菌、流行性出血熱、狂犬病等。 （3）腫瘤標(biāo)志物類：卵巢癌、乳腺癌、胃腸道癌、癌胚抗原、甲胎蛋白、膀胱癌、鐵蛋白等。 （4）內(nèi)分泌類：T3、T4、促卵泡生成素(FSH)、黃體生成素(LH)、泌乳素(PRL)、人絨毛促性腺激素(HCG)、睪酮(TESTO)、孕酮(PROG)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、生長素(HGH)、促甲狀腺素(TSH)、皮質(zhì)醇或皮質(zhì)酮(C)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)等。 （5）自身抗體類：ENA全套6項(xiàng)篩選、抗核抗體、抗Sm抗體、抗精子抗體、抗雙鏈/單鏈DNA、紅斑狼瘡篩選等。 （6）Torch類、病毒感染類：弓形蟲、巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒等。 （7）細(xì)胞因子類：白細(xì)胞介素、可溶性CD抗原,十