流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng)

1、流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng),流加發(fā)酵,所謂流加發(fā)酵，即補(bǔ)料分批發(fā)酵(Fed-batch fermentation)，有時(shí)又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過(guò)程中間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方法,分批、連續(xù)、流加操作方式的比較,流加發(fā)酵的研究進(jìn)展,在20世紀(jì)70年代以前流加發(fā)酵的理論研究幾乎是個(gè)空白，流加過(guò)程控制僅僅以經(jīng)驗(yàn)為主，流加方式也僅僅局限于間歇或恒速流加 1973年日本學(xué)者Yoshida等人首次提出了“Fed-Batch Fermentation”這個(gè)術(shù)語(yǔ)，并從理論上建立了第一個(gè)數(shù)學(xué)模型，流加發(fā)酵的研究才開(kāi)始進(jìn)入理論研究階段,流加發(fā)酵所取得的三個(gè)方面的重大進(jìn)展,20世紀(jì)70年代中后

2、期對(duì)流加發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)解析 結(jié)合發(fā)酵過(guò)程的可測(cè)參數(shù)對(duì)流加過(guò)程進(jìn)行反饋控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸商)法、pH法、代謝物法、螢光法等） 流加發(fā)酵的最優(yōu)化研究,流加發(fā)酵最優(yōu)化研究的核心問(wèn)題是找出最佳的底物流加方式，以維持發(fā)酵過(guò)程始終處于最佳狀態(tài) 流加發(fā)酵最優(yōu)化的研究?jī)?nèi)容包括： （1）狀態(tài)方程的建立 （2）目標(biāo)泛函的確定 （3）最優(yōu)化底物流加方式的求解,流加發(fā)酵的物料衡算式可以表達(dá)為,流加發(fā)酵的最優(yōu)化理論有：格林原理、龐特里金最小值(最大值)原理等,在采用流加發(fā)酵技術(shù)之前要考慮的兩個(gè)問(wèn)題 一、何時(shí)采用流加發(fā)酵方式？ 二、如何進(jìn)行底物的流加,一、何時(shí)采用流加發(fā)酵方式？ 所用底物在高濃度時(shí)對(duì)菌

3、體生長(zhǎng)有抑制作用 高菌體濃度培養(yǎng)即高密度培養(yǎng)系統(tǒng) 非生長(zhǎng)耦聯(lián)性次級(jí)代謝產(chǎn)物(如產(chǎn)物的合成需要某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或前體) 利用營(yíng)養(yǎng)突變體的系統(tǒng)(過(guò)量加入營(yíng)養(yǎng)物只能使菌體迅速生長(zhǎng)，而目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量會(huì)減少。而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物嚴(yán)重缺乏時(shí)，菌體生長(zhǎng)受抑制，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也會(huì)減小 ) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng),二、如何進(jìn)行流加發(fā)酵操作？ 1. 流加發(fā)酵類(lèi)型 2. 采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的關(guān)鍵問(wèn)題？ 3.流加發(fā)酵過(guò)程中某些重要參數(shù)的確定 4.合適的流加發(fā)酵類(lèi)型的確定 5. 流加方式的應(yīng)用,1. 流加發(fā)酵類(lèi)型,流加發(fā)酵的分類(lèi),2. 采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的關(guān)鍵問(wèn)題 (1) 流加什么物質(zhì)？ 補(bǔ)充微生物能源和碳源，如在發(fā)酵液中添加

4、葡萄糖、 飴糖、液化淀粉。作為消泡劑的天然油脂，有時(shí)也能同時(shí)起到補(bǔ)充碳源的作用 補(bǔ)充菌體所需要的氮源，有機(jī)氮或氨水 加入某些微生物生長(zhǎng)或合成需要的微量元素或無(wú)機(jī)鹽 加入酶合成誘導(dǎo)物或前體物質(zhì),2) 如何流加？ a.底物流加速率 b.流加開(kāi)始時(shí)間及總流加時(shí)間 c.需控制的底物濃度,3. 流加發(fā)酵過(guò)程中某些重要參數(shù)的確定 最佳底物濃度的確定 (包括菌體生長(zhǎng)階段和產(chǎn)物合成階段) b. 底物的消耗速率 c. 菌體比生長(zhǎng)速率() d. 菌體對(duì)底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yx/s) 及產(chǎn)物對(duì)底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yp/s,4. 合適的流加發(fā)酵類(lèi)型的確定 a.恒速流加(包括單一速率和分階段恒速流加) b.指數(shù)速率流加 c.底

5、物在線測(cè)定后的反饋流加 (如葡萄糖反饋流加) d. pH-stat e. DO-stat,5. 流加方式的應(yīng)用 (1) 恒速流加,采用恒流速流加培養(yǎng)時(shí)，可得到如下的物料平衡方程式： 細(xì)胞平衡： 碳平衡： 產(chǎn)物平衡： 體積平衡,恒流速流加過(guò)程中的流量F的確定： 預(yù)試驗(yàn)中所得出的流加時(shí)刻菌體對(duì)所流加基質(zhì)的消耗速率 發(fā)酵液中殘留基質(zhì)濃度 流加后需要控制的發(fā)酵液中的基質(zhì)濃度,2) 指數(shù)速率流加 在菌體生長(zhǎng)階段采用指數(shù)速率流加法的幾點(diǎn)假設(shè)如下： (a) 發(fā)酵罐內(nèi)為理想混合； (b) 葡萄糖為唯一限制性碳源； (c) 殘留菌體對(duì)葡萄糖的產(chǎn)率系數(shù)(YX/s)為常數(shù)； (d) 菌體生長(zhǎng)遵循Monod方程,對(duì)底

6、物葡萄糖進(jìn)行衡算，則： F為體積流加速率(L/h)，S0為流加液中基質(zhì)濃度(g/L)，Yx/s為菌體對(duì)底物的產(chǎn)率系數(shù)(g/g)，ms為細(xì)胞比維持系數(shù)(g/g/h)，X為菌體濃度(g/L)，V為培養(yǎng)液體積(L)，為菌體比生長(zhǎng)速率(h-1,對(duì)菌體量的變化進(jìn)行物料衡算，則,假定為常數(shù)，則上式積分可得,由于生長(zhǎng)符合Monod方程是S的函數(shù)，要使恒定，S必須恒定，則有,其中tF為開(kāi)始指數(shù)速率流加的時(shí)間， ttF，XF和VF分別為tF時(shí)刻的菌體濃度和發(fā)酵液體積,指數(shù)速率流加的速率F的表達(dá)式為,指數(shù)速率流加方式在實(shí)際過(guò)程中的注意事項(xiàng)： 方程中各參數(shù)要預(yù)先求知 應(yīng)用時(shí)流加速率F可采用階梯遞增方式進(jìn)行設(shè)定,微生

7、物的高細(xì)胞密度培養(yǎng),概述,發(fā)酵研究和工業(yè)的一個(gè)主要目標(biāo)是使體積生產(chǎn)率（g/Lh）最大化，即在給定體積中和一定時(shí)間內(nèi)獲得盡可能多的產(chǎn)品數(shù)量。 高細(xì)胞密度培養(yǎng)是高生產(chǎn)效率的要求。 歷史上，高細(xì)胞密度培養(yǎng)首先建立在酵母上，用以生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白、乙醇和菌體,后來(lái)，建立起其它的嗜溫菌的高密度培養(yǎng)，生產(chǎn)各種類(lèi)型產(chǎn)品。 甲基營(yíng)養(yǎng)生物的高密度培養(yǎng)導(dǎo)致了聚羥基烷酸的高效生產(chǎn),如今，微生物的高細(xì)胞密度培養(yǎng)的范疇已包括細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物（酵母,概述,HCDC中各種微生物的最大細(xì)胞密度,概述,隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，利用大腸桿菌或其它微生物為宿主表達(dá)重組蛋白（如干擾素、白介素等）在分子和策略上已沒(méi)有問(wèn)題。但為了提

8、高過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性必需開(kāi)發(fā)高效的培養(yǎng)和發(fā)酵技術(shù),對(duì)大腸桿菌的分子生物學(xué)和生理學(xué)知識(shí)的熟識(shí)，使得它成為高細(xì)胞密度培養(yǎng)的先鋒微生物,概述,反應(yīng)器,HCDC過(guò)程示意圖,概述,概述,反應(yīng)器,HCDC的生物反應(yīng)器類(lèi)型包括： 具有底物流加裝置的通用式攪拌罐反應(yīng)器 帶有各種內(nèi)置或外置細(xì)胞維持裝置的攪拌罐反應(yīng)器 膜透析反應(yīng)器 氣升式反應(yīng)器 陶瓷膜搖瓶,透析反應(yīng)器,反應(yīng)器,HCDC問(wèn)題的解決,HCDC遇到的主要問(wèn)題有： 產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的積累對(duì)生長(zhǎng)的抑制 氧的限制 HCDC中培養(yǎng)基粘度不斷增加，引起混合不充分 CO2和熱量的高釋放率,下面以大腸桿菌為例，來(lái)探討如何解決HCDC中的問(wèn)題,大腸桿菌HCDC中乙酸的形成,

9、乙酸是大腸桿菌流入中心代謝途徑的碳超過(guò)生物合成的需要和產(chǎn)生能量超過(guò)細(xì)胞的容量時(shí)產(chǎn)生的。 高濃度的乙酸（如pH7，超過(guò)5gL-1）會(huì)降低HCDC的生長(zhǎng)速率、生物量和可獲得的最大細(xì)胞密度。 乙酸毒害作用的機(jī)理還未被闡明。很有可能是因?yàn)橐种艱NA、RNA、蛋白質(zhì)和脂肪的合成,HCDC遇到的問(wèn)題,控制比生長(zhǎng)速率在產(chǎn)生乙酸的臨界值以下 一般可通過(guò)控制限制性底物濃度控制比生長(zhǎng)速率。 比生長(zhǎng)速率臨界值： 在復(fù)合和半合成培養(yǎng)基中，約為為0.2h-1和0.35h-1； 在合成培養(yǎng)基中，為0.14h-1,HCDC遇到的問(wèn)題,減少乙酸合成的方法,選擇合適的培養(yǎng)基 例如，甘油比葡萄糖吸收進(jìn)入細(xì)胞的速度要慢，可能會(huì)減少

10、流入糖酵解途徑的碳，這會(huì)極大的減少乙酸的合成,HCDC遇到的問(wèn)題,此外，加入某些氨基酸（如谷氨酸、甲硫氨酸），可減輕乙酸的毒害作用。 使用酸和堿調(diào)節(jié)pH而積累下來(lái)的鹽會(huì)使乙酸的毒害作用加強(qiáng),大腸桿菌,葡萄糖,Pta,Ack,乙酸,去往其它產(chǎn)物（乙醇、乙醛等,TCA循環(huán)中過(guò)剩的碳,乙酸代謝過(guò)程示意圖,磷酸轉(zhuǎn)移酶體系,代謝工程的方法減少乙酸合成,CoA,氧的限制,氧經(jīng)常是高細(xì)胞密度培養(yǎng)的限制因素。 因?yàn)檠醯娜芙舛群艿汀?5、1大氣壓下，水中飽和溶解氧濃度為7mgL-1,HCDC遇到的問(wèn)題,提高溶氧的方法有： 提高通氣速率和攪拌速度 富氧空氣和純氧 在加壓環(huán)境下培養(yǎng),混合的限制,HCDC的另一個(gè)物理

11、限制。 發(fā)酵罐體積越大問(wèn)題越明顯。 靠近進(jìn)料口部分的細(xì)胞暴露在高濃度營(yíng)養(yǎng)物中。 而其它位置的細(xì)胞則處于饑餓狀態(tài),HCDC遇到的問(wèn)題,有必要研究發(fā)酵罐中的攪拌模型，找到改善攪拌的方法,二氧化碳和放熱的影響,HCDC中高細(xì)胞密度培養(yǎng)中的二氧化碳會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。高CO2分壓（0.3atm）會(huì)降低生長(zhǎng)速率并刺激乙酸的生成,放熱也是高細(xì)胞密度培養(yǎng)的一個(gè)問(wèn)題,這些問(wèn)題可通過(guò)降低細(xì)胞比生長(zhǎng)速率而部分的解決,熱量的主要來(lái)源是攪拌產(chǎn)生的機(jī)械熱和細(xì)胞代謝產(chǎn)生的熱量,HCDC遇到的問(wèn)題,溫度的影響,把培養(yǎng)溫度從37降到2630，會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)速度，因此會(huì)減少有毒副產(chǎn)物和代謝產(chǎn)生的熱量。 降低溫度也能減少細(xì)胞

12、對(duì)氧的需求。 降低重組細(xì)胞溫度也有可能減少包含體形式的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生,以上這些優(yōu)點(diǎn)說(shuō)服了許多研究者使用低溫，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行高細(xì)胞密度培養(yǎng),HCDC遇到的問(wèn)題,流加控制策略,有兩種主要的營(yíng)養(yǎng)流加控制策略： 開(kāi)環(huán)（無(wú)反饋）控制 閉環(huán)（反饋）控制,補(bǔ)料方式是高細(xì)胞密度培養(yǎng)取得成功的關(guān)鍵因素。 它不僅影響最大可獲得細(xì)胞的濃度，而且影響細(xì)胞的產(chǎn)率。 產(chǎn)物形成會(huì)受各種補(bǔ)料策略的影響。 高細(xì)胞密度培養(yǎng)通常在營(yíng)養(yǎng)（碳）限制的條件下進(jìn)行,條件,預(yù)設(shè)參數(shù),開(kāi)環(huán)（無(wú)反饋）控制,流加控制策略,控制,無(wú)反饋控制的流加策略,恒速流加以預(yù)先決定的（恒定的）速率流加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，比生長(zhǎng)速率逐漸降低。 加速流加以逐漸增加的速率流加營(yíng)

13、養(yǎng)物質(zhì)?？裳a(bǔ)償一些比生長(zhǎng)速率的降低。 指數(shù)流加以指數(shù)的速率流加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。可得到恒定的比生長(zhǎng)速率,流加控制策略,條件,閉環(huán)（反饋）控制,即時(shí)DO,即時(shí)pH,CER,細(xì)胞濃度,碳源濃度,反饋控制,流加控制策略,控制,間接反饋控制 即時(shí)DO當(dāng)DO降低時(shí)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 即時(shí)pH主要碳源耗盡引起pH上升時(shí)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 二氧化碳釋放率（CER）CER基本正比于碳源的消耗速度。這一方法最為經(jīng)常用于控制比生長(zhǎng)速率。 細(xì)胞濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流加速率由細(xì)胞濃度決定,反饋控制,流加控制策略,直接反饋控制,流加控制策略,底物濃度控制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流加速率直接由主要碳源的濃度控制 例如，使用一種在線葡萄糖分析儀控制發(fā)酵罐中的葡萄糖,結(jié)論,很多微生物都可通過(guò)前面提到的補(bǔ)料方式進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)，生長(zhǎng)到高密度。 現(xiàn)在，通過(guò)控制乙酸的濃度低于抑制水平，大腸桿菌可以很容易的獲得大于100g（DCW）L-1的細(xì)胞干重。 控制比生長(zhǎng)速率低于乙酸形成的臨界值的指數(shù)流加方法是相當(dāng)有用的。因?yàn)樗?jiǎn)單且不需要任