干細胞治療心律失常應(yīng)用、問題與展望

1、干細胞治療心律失常 應(yīng)用、問題與展望,干細胞研究被科學雜志評為世界十大科技成果之一 現(xiàn)在每年大約有4000余篇關(guān)于干細胞研究的論文在國際雜志上發(fā)表,干細胞治療心律失常研究成為熱點,干細胞在心律失常的應(yīng)用,構(gòu)建生物起搏器 SSS AVB 重建房室傳導(dǎo)通路 AVB,構(gòu)建生物起搏器,第一部分,2001年，心臟起搏器與因特網(wǎng)分獲美國國立工程院最高獎,為什么要構(gòu)建生物起搏器,Dr. S. Furman (1960, NY,起搏器治療效果已得到世界公認與肯定,一、電子起搏器的不足,諸多并發(fā)癥 感染 出血 心肌穿孔 起搏器功能障礙 電池耗竭需定期更換 右心室心尖起搏，不符合生理，可引起心功能惡化 心理負擔：

2、兒童和青少年,生物起搏器應(yīng)具備特點,終身產(chǎn)生穩(wěn)定的生理節(jié)律,不對機體產(chǎn)生有害作用,緩慢性心律失常的治愈,無誘發(fā)腫瘤、免疫排斥,不需反復(fù)移植,二、生物起搏器的特點,構(gòu)建生物起搏器的方法,第二部分,3.增加舒張期內(nèi)向電流,4.將干細胞或體細胞調(diào)控為自律細胞,2.降低細胞復(fù)極電流,構(gòu)建生物起搏器的方法,1.上調(diào)細胞腎上腺能活性,5.將干細胞轉(zhuǎn)染起搏基因,上調(diào)細胞腎上腺能活性,1,轉(zhuǎn)染腎上腺能受體基因,動物實驗,動物實驗,Edelberg等在 1998年把人的2受體基因轉(zhuǎn)染到大鼠的心臟，使其過度表達，結(jié)果大鼠的心率增加了 40,2受體基因質(zhì)粒,心率增加40,動物實驗,Edelberg等在 2001年把

3、人的2受體基因質(zhì)粒注射到豬的右心房，48小時后出現(xiàn)心房節(jié)律，此節(jié)律心率增加了 50,對腎上腺能刺激起反應(yīng)，心率增加50,2受體基因質(zhì)粒,意義,使心室肌或心房肌細胞的逸搏頻率增快 可治療竇房結(jié)病變或房室傳導(dǎo)阻滯,降低細胞膜靜息電位（復(fù)極電流,2,Ik1內(nèi)向整流電流,竇房結(jié)細胞,心室肌細胞,Ik1內(nèi)向整流電流,2002、2003年 Miake在 Nature,Ik1編碼基因是Kir2.1,重組基因Kir2.1AAA抑制,心室肌細胞轉(zhuǎn)變?yōu)轭惛]房結(jié)自律細胞,本實驗結(jié)論,降低靜息電位，可使內(nèi)向電流啟動而觸發(fā)起搏 抑制Ik1可使心室肌細胞轉(zhuǎn)換為起搏細胞 細胞內(nèi)定位轉(zhuǎn)染Kir2.1AAA能夠建立生物起搏點，

4、以達到治療目的 此技術(shù)存在的問題：可產(chǎn)生局灶異位自發(fā)節(jié)律，與心室節(jié)律競爭,3,3.增加舒張期內(nèi)向電流（起搏電流，If電流,建立起搏電流 If電流,If電流的基因編碼為HCN,3個亞基在心臟HCN1,HCN2,HCN4,轉(zhuǎn)染HCN基因可將普通細胞改變?yōu)槠鸩毎?動物實驗,Qu等在 2003年把包含HCN2的腺病毒注射到犬左房內(nèi),HCN2基因腺病毒,注射點出現(xiàn)心房節(jié)律 此處心肌細胞的If電流強100倍,動物實驗,Plotnikov等( 2004年)導(dǎo)管法將HCN2腺病毒顆粒注射到犬左束支內(nèi),注射點出現(xiàn)穩(wěn)定的自發(fā)心室異位節(jié)律，60bpm 注射點HCN高度表達,HCN2腺病毒顆粒,細胞移植,4,異體細

5、胞移植,Ruhparwar 將胎犬心房肌細胞（包含竇房結(jié)）移植到成年犬的左心室游離壁 移植細胞成為受體心臟新的起搏點 供體細胞和受體細胞之問建立間隙連接 起搏點對異丙腎上腺素起反應(yīng),Rllhparwar A，et a1Eur J Cardiothorac surg.2002；21：853857,動物實驗,采用酶消化法分離新生約克夏豬右心房組織(包括竇房結(jié)) 制備成5l0 個mL心肌細胞懸液 開胸直視下將l mL懸液注入幼年豬左心室游離壁 移植細胞均成活，并與周圍心肌發(fā)生電、化學連接，主導(dǎo)心室節(jié)律 對異丙腎上腺素發(fā)生反應(yīng),動物實驗,Cai J，et a1Transplanted neonatal

6、 cardiomyocytes as a potential biological pacemaker in pigs with complete atrioventricular blockTransplantation，2006，81(7)：10221026,男性人胚胎心房肌細胞(竇房結(jié)細胞)移植到雌性豬左室壁 細胞移植后動物心室率較未進行細胞移植的快 電生理表明心室節(jié)律起自細胞移植區(qū)： PCR檢測證實細胞移植區(qū)出現(xiàn)SRY基因 在移植細胞與宿主細胞之間出現(xiàn)了連接蛋白43,動物實驗,Lin G，et a1Biological pacemak er created by fetal cardi

7、omyocyte transplantationJ Biomed Sci，2005，l2(3)：513_519,異體細胞移植存在的問題,有異體排斥反應(yīng)； 移植的胚胎體細胞對異體移植部位的微環(huán)境適應(yīng)性差； 供體細胞來源困難,5.將胚胎干細胞調(diào)控為起搏細胞,5,Satin等研究人ESC分化的心肌細胞，其藥理敏感性和離子通道特性，發(fā)現(xiàn)該細胞具有自發(fā)的起搏興奮特性，可作為心臟起搏細胞,Satin J，et a1J Physiol，2004，559：479-496,動物實驗,Kehat用人ESC在體外培養(yǎng)出心肌細胞移植物，與體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞之間建立了電-機械聯(lián)系 用豬建立了一個完全型房室傳導(dǎo)阻滯模

8、型 將培養(yǎng)的心肌細胞移植入受體心臟，可觀察到受體和供體的電一機械融合 移植細胞能成功使心室節(jié)律性起搏,動物實驗,Kehat I，et a1Nat Bio technol，2004，22(10)：1282-1289,Xue等 將人胚胎干細胞修飾為起搏細胞 在體外使靜止的心室肌細胞產(chǎn)生節(jié)律性的電一收縮活動 B腎上腺素、利多卡因等藥物能調(diào)控其跳動速度 將這些細胞注射到豚鼠左室前壁，即能驅(qū)動心室搏動，形成起搏點,Xue T，et a1Circulation，2005，111：11-20,動物實驗,優(yōu)勢,胚胎干細胞為全能干細胞，具有建系傳代、全能分化、干細胞永生化、增殖能力強等方面優(yōu)勢,問題,一、胚胎干

9、細胞具有向終末細胞分化的特性，而分化為終末細胞則失去起搏特性。因此精確控制干細胞分化并終止于竇房結(jié)細胞階段是一個絕技 二、尚不清楚具備起搏功能的胚胎干細胞，是否具有人類心臟起搏細胞同樣的離子通道,限制,社會倫理問題 胚胎干細胞具有致心律失常源性 胚胎干細胞具有免疫源性 致腫瘤性,6,6.將間葉干細胞構(gòu)建為生物起搏器,骨髓間葉干細胞移植構(gòu)建生物起搏器,方法一 動物實驗,優(yōu)點,間葉干細胞容易分離培養(yǎng) 多系分化增殖 無免疫排斥 不存在倫理問題 易于分化誘導(dǎo)為自律細胞,實驗理論基礎(chǔ),間葉干細胞具備起搏潛能（電生理實驗） 干細胞間高度表達特異性縫隙連接蛋白Cx40和Cx43 細胞電生理和染料傳遞（dye

10、-transfer）實驗表明干細胞之間、干細胞與心肌細胞之間存在偶聯(lián)(couple)現(xiàn)象 動物實驗表明，干細胞之間、干細胞與宿主心肌細胞之間建立Cx43縫隙連接(gap junction,首先培養(yǎng)骨髓間葉干細胞,病竇模型制作手術(shù)室及射頻儀與多導(dǎo)心電記錄儀,病竇模型制作,將誘導(dǎo)干細胞移植于竇房結(jié)區(qū),開胸，暴露竇房結(jié)區(qū),骨髓干細胞移植后動物竇房結(jié)功能改善，心率由110bpm增加到170bpm,對照組犬竇房結(jié)功能未見改善，心率未恢復(fù)至170bpm,注射阿托品未見心率增加,對照組竇房結(jié)功能未見改善,注射阿托品未見心率增加,對照組血管密度低，未見BrdU標記細胞,骨髓干細胞移植區(qū)可見BrdU染色陽性新生

11、心肌細胞,免疫組化研究,BrdU染色陽性的新生細胞Troponin I 陽性,移植區(qū)可見較多新生血管，其內(nèi)皮細胞BrdU陽性，表明新生血管內(nèi)皮細胞來源于骨髓細胞,免疫組化研究,移植骨髓細胞其Cx 43染色陽性，表明骨髓分化細胞建立了縫隙連接,免疫組化研究,結(jié)論,移植骨髓細胞在體內(nèi)可分化為典型的心肌細胞與血管內(nèi)皮細胞 移植骨髓細胞可與宿主細胞建立縫隙連接 移植細胞可替代損傷的竇房結(jié)發(fā)揮自律起搏功能 可建立生物起搏器,7、轉(zhuǎn)染起搏電流基因HCN 干細胞移植構(gòu)建生物起搏器,7,實驗 1起搏電流,將骨髓干細胞轉(zhuǎn)染HCN和熒光標志GFP，并測量其起搏電流 銫能夠封閉該通道 符合起搏電流If的特性,Pot

12、apova I, et al. Circ Res, 2004; 94: 952,實驗 2體外模型,將裝載GFPHCN2基因干細胞以點狀種植于載玻片上 其周圍種植新生大鼠心室肌細胞 建立以干細胞為中心，心肌細胞在周圍的類似竇房結(jié)樣結(jié)構(gòu),Potapova I, et al. Circ Res, 2004; 94: 952,在裝載HCN2干細胞周圍的心肌細胞，其自發(fā)搏動節(jié)率明顯快于對照組的節(jié)率,Potapova I, et al. Circ Res, 2004; 94: 952,將裝載起搏基因的間葉干細胞直接點狀注射到犬左室心外膜 注射裝載HCN2+GFP干細胞的犬有自發(fā)心室節(jié)律，頻率大約60bpm

13、，起搏點位于注射部位 在注射點可檢測到裝載熒光標志GFP的成人間葉干細胞 證實移植干細胞之間、干細胞與宿主心肌細胞之間形成了縫隙連接,實驗 3體內(nèi)模型,Potapova I, et al. Circ Res, 2004; 94: 952,構(gòu)建房室傳導(dǎo)通路-解決房室阻滯,第三部分,移植干細胞,組織工程技術(shù),實驗一 干細胞移植治療房室傳導(dǎo)阻滯 Xiaoqing Ren, et al. Cardiac atrioventricular conduction improved by autologous transplantation of mesenchymal stem cells in cani

14、ne atrioventricular block models. J Geriatr Cardiol, 2007, 4(4): 238-243,1,移植分化的間葉干細胞重建房室傳導(dǎo),射頻消融制備三度房室阻滯模型,將誘導(dǎo)干細胞移植于房室結(jié)區(qū),干細胞移植可改善房室傳導(dǎo),干細胞移植后房室傳導(dǎo)功能改善 干細胞在房室結(jié)區(qū)分化為心肌細胞與血管內(nèi)皮細胞 干細胞與宿主細胞建立縫隙連接 移植干細胞具備電傳導(dǎo)功能,實驗二 組織工程技術(shù)重建房室傳導(dǎo)功能 Choi YH, et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 2006 ;

15、169(1):72-85,2,組織工程技術(shù),組織工程技術(shù)重建房室傳導(dǎo)功能,分離和培養(yǎng)大鼠成肌干細胞 制備三維結(jié)構(gòu)的組織工程移植物222mm,組織工程技術(shù)重建房室傳導(dǎo)功能,開胸將三維組織工程移植體縫埋到動物房室溝內(nèi) 移植體內(nèi)的干細胞具有縫隙連接功能 組織工程移植體具備電傳導(dǎo)功能,結(jié)論,移植干細胞可與宿主細胞建立縫隙連接，具備傳導(dǎo)功能 移植干細胞可替代損傷的房室結(jié)發(fā)揮傳導(dǎo)功能 分化干細胞移植或組織工程技術(shù)改善、重建房室傳導(dǎo)功能，有望取代電子起搏器,第四部分,細胞移植存在的問題,1、異體細胞移植存在的問題,有異體排斥反應(yīng)； 移植的胚胎體細胞對異體移植部位的微環(huán)境適應(yīng)性差； 供體細胞來源困難,2、胚胎干細胞移植存在的問題,社會倫理問題 致心律失常源性 具有免疫源性 致腫瘤性,3、骨髓干細胞移植存在的問題,移植骨髓干細胞難以持久存活 隨干細胞轉(zhuǎn)染的基因難以長期持久高效表達,4、骨骼肌成肌細胞移植存在的問題,致心律失常 體內(nèi)長期存活,5、干細胞移植致心律失常性,研究表明：胚胎干細胞、骨骼肌成肌細胞移植于心臟可以致心律失常 骨髓干細胞、內(nèi)皮祖細胞移植未見致心律失?，F(xiàn)象,Mocini D et al. Ital Heart J, 2005; 6(3