生物分析化學課件

1、第四章 生物分析化學,4.1 慨述 4.1.1 任務與作用 以分析化學理論、技術和方法為基礎 以生物化學和分子生物學理論技術為補充 以數(shù)學、物理學和計算機技術為手段,第1頁,測量并獲取生物/化學信息的前沿性交叉學科,三個主要任務,作為化學生物學的核心內(nèi)容之一，它通過各種各樣的 方法和手段得到分析數(shù)據(jù)，獲取各種物質(zhì)的組成、結 構和功能等方面的信息，從而為化學生物學的深入研 究創(chuàng)造條件,第2頁,1、提供生物活性物質(zhì)的組成、含量、結構、形態(tài)等方面的信息,2、發(fā)展獲取上述信息的方法以及復雜生物物質(zhì)的分離和純化技術,3、創(chuàng)制用于研究生命活性物質(zhì)間相互作用的技術手段,生物分析化學的獨特內(nèi)涵,第3頁,1、研

2、究對象是生命活性物質(zhì)，既包括核酸、蛋白質(zhì)等大分子， 又含有種類繁多的活性小分子和調(diào)控分子,2、研究手段獨特，生命體內(nèi)的活性物質(zhì)結構復雜、化學性質(zhì)相似、 生物活性各異，并且在生理條件下相互關聯(lián)，對它們的分析測試 要求是非破壞性的原位、活體分析,第4頁,3、細胞是生物體的基本單元，生命活性物質(zhì)在細胞內(nèi)存在并隨時 空和外界刺激而運動和變化，因此生物分析化學研究微環(huán)境和 時空中的多維信息，更重要的是通過生物體內(nèi)物質(zhì)的相對簡單 化學成分，但組合與排序構筑了復雜多變的特殊形態(tài)和多級 結構，它在服從化學基本作用規(guī)律的基礎上更多地體現(xiàn) 生物方面的規(guī)律,4、生命過程研究需要同時獲取大量各類分子相互作用的生化信息

3、， 因此，高速、高通量分析方法顯得尤為重要,4.1.2 分類 物質(zhì)種類繁多，研究內(nèi)容極其豐富； 可按 分析方法和功能分類； 分析方法：化學分析、儀器分析； 功能分類：分離分析、結構分析和定量分析,第5頁,分離分析是指將復雜的生物體內(nèi)物質(zhì)分離成 單一組分或組組分的一類方法，它主要包括電 泳（毛細管電泳、二維凝膠電泳和微控芯片電 泳等）、色譜技術等。 特點是綜合多種技術手段將分離與分析有機 地結合在一起，提高工作效率,第6頁,2. 結構分析： 生物物質(zhì)結構復雜，且結構決定其特有的 性質(zhì)和功能。 研究生物物質(zhì)結構和構象的方法很多，總體上分 為兩大類：一類是測定溶液狀態(tài)下的分子構象，如核 磁共振、圓二

4、色譜、激光拉曼光譜、熒光光譜、紫外 光譜等波譜分析法；另一類是測定分子的晶體結構， 如x-射線衍射分析法和小角中子衍射法,第7頁,3. 定量分析：生物分析化學研究的基本任務是確定生物物質(zhì)的含量。 其特點,物質(zhì)含量極低 富集、分離,測定方法 靈敏度高、準確、 快速、簡便、 專一性,第8頁,4.4 生物活性小分子分析 生物活性小分子是具有維持機體正常功能、 調(diào)節(jié)生命活動過程的化學物質(zhì)的總稱,內(nèi)源性,外源性,細胞分泌信號物質(zhì) 傳遞細胞 內(nèi)/間的信息 調(diào)節(jié)自身及其他 細胞的代謝和功能,調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝 和維持生理功能,第9頁,部分生物活性小分子及功能,第10頁,4.4.1 一氧化氮分析 一氧化氮是機體內(nèi)一

5、種作用獨特的信號分 子，在不同的器官、不同生理或病理狀態(tài)下均 存在著利與弊的雙重影響。 目前，檢測NO的方法有光化學（紫外可見分 光光度法、熒光法、化學發(fā)光）、電化學法、 電子自旋共振法和生物檢測法,第11頁,近來發(fā)現(xiàn)一氧化氮（nitric oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)各組織中， 特別是神經(jīng)組織中。它是一種新型生物信使分子，1992年被美國Science 雜志評選為明星分子。NO是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，分子小，結構 簡單，常溫下為氣體，微溶于水，具有脂溶性，可快速透過生物膜擴散， 生物半衰期只有35s，其生成依賴于一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase , NO

6、S ）并在心、腦血管調(diào)節(jié)、神經(jīng)、免疫調(diào)節(jié)等方面有著 十分重要的生物學作用,1）在心血管系統(tǒng)中 NO在維持血管張力的恒定和調(diào)節(jié)血壓的穩(wěn)定性中 起著重要作用,在生理狀態(tài)下，當血管受到血流沖擊、灌注壓突然升高時，NO作為平衡 使者維持其器官血流量相對穩(wěn)定，使血管具有自身調(diào)節(jié)作用。能夠降低 全身平均動脈血壓，控制全身各種血管床的靜息張力，增加局部血流， 是血壓的主要調(diào)節(jié)因子,NO在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮作用的可能機制是通過提高細胞中鳥苷酸環(huán)化酶 （guanylate cyclase , GC）的活性，促進磷酸鳥苷環(huán)化產(chǎn)生環(huán)一磷酸鳥苷 （guanosine 3, 5cyclic monophosphate c

7、GMP），使細胞內(nèi)cGMP水平 增高，繼而激活依賴cGMP的蛋白激酶對心肌肌鈣蛋白的磷酸化作用加強， 肌鈣蛋白c對Ca2+的親合性下降，肌細胞膜上K+通道活性也下降，從而導致 血管舒張,NO的生物學作用,2）在免疫系統(tǒng)中 研究結果表明，NO可以產(chǎn)生于人體內(nèi)多種細胞。 如當體內(nèi)內(nèi)毒素或T細胞激活巨噬細胞和多形核白細胞時，能產(chǎn)生大量的 誘導型NOS和超氧化物陰離子自由基，從而合成大量的NO和H2O2，這在 殺傷入侵的細菌、真菌等微生物和腫瘤細胞、有機異物及在炎癥損傷方面 起著十分重要的作用,目前認為，經(jīng)激活的巨噬細胞釋放的NO可以通過抑制靶細胞線粒體中 三羧酸循環(huán)、電子傳遞和細胞DNA合成等途徑，

8、發(fā)揮殺傷靶細胞的效應,免疫反應所產(chǎn)生的NO對鄰近組織和能夠產(chǎn)生NOS 的細胞也有毒性作用。 某些與免疫系統(tǒng)有關的局部或系統(tǒng)組織損傷，血管和淋巴管的異常擴張 及通透性等，可能都與NO在局部的含量有著密切的關系,連續(xù)刺激小腦的上行纖維和平行纖維可引起平行纖維細胞的神經(jīng)傳導 產(chǎn)生長時程抑制(Long-term depression , LTD)，被認為是小腦運動學習 體系中的一種機制，NO參與了該機制,3）在神經(jīng)系統(tǒng)中 有關L-Arg NO途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)方面的 研究認為，NO通過擴散，作用于相鄰的周圍神經(jīng)元如突出前神經(jīng)末梢和星狀 膠質(zhì)細胞，再激活GC從而提高水平cGMP水平而產(chǎn)生生理效

9、應。如NO可誘導 與學習、記憶有關的長時程增強效應（Long-term potentiation , LTP）， 并在其LTP中起逆信使作用,在外周神經(jīng)系統(tǒng)也存在L-Arg NO途徑。NO被認為是非膽堿能、非 腎上腺素能神經(jīng)的遞質(zhì)或介質(zhì)，參與痛覺傳入與感覺傳遞過程,現(xiàn)已證明在人體內(nèi)廣泛存在著以NO為遞質(zhì)的神經(jīng)系統(tǒng)，它與腎上腺素能、 膽堿能神經(jīng)和肽類神經(jīng)一樣重要。若其功能異常就可能引起一系列疾病,另據(jù)報道，NO在胃腸神經(jīng)介導胃腸平滑肌松弛中起著重要的中介作用， 在胃腸間神經(jīng)叢中，NOS和血管活性腸肽共存并能引起非腎上腺素能 非膽堿能（nonadrenergic-non-cholinerrgic

10、, NANC）舒張，但血管 活性腸肽的抗體只能部分消除NANC的舒張，其余的舒張反應則能被N- 甲基精氨酸消除,NO作為NANC神經(jīng)元遞質(zhì)，在泌尿生殖系統(tǒng)中起著重要作用。成為排尿 節(jié)制等生理功能的調(diào)節(jié)物質(zhì)，這為藥物治療泌尿生殖系統(tǒng)疾病提供了 理論依據(jù),4.4.2 兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)分析,兒茶酚胺類（catecholamines,CAs）是絡氨酸衍生 物的總稱，包括多巴、多巴胺、腎上腺素、去甲腎上 腺素和5-羥色胺等物質(zhì)。CAs類物質(zhì)是人體一類重要的 神經(jīng)遞質(zhì)和激素，對心血管、神經(jīng)等組織系統(tǒng)的生理 活動起著調(diào)控作用，與一些功能性疾病以及器質(zhì)性的 病變有密切關系。 研究這類物質(zhì)的分析方法，對于了解

11、他們在生命體內(nèi)的調(diào)控 機制以及相關的藥理學研究和疾病診斷均具有十分重要的意 義,第12頁,4.4.3 興奮劑檢測（doping control,興奮劑是IOC 和其他國際體育組織所確定 的禁用藥物（濫用藥物，doping），運動員 以非正常量服用這些藥物后可以在某種程度 上提高他們的競賽能力。從本質(zhì)上講，興奮 劑是一類對人體生理機能有重要影響的刺激 性藥物，是一類特殊的生物活性小分子,第13頁,第14頁,欺騙公眾，欺騙法律，欺騙家人，欺騙自己，騙了七年，馬里恩 瓊斯終于累了！看著她淚流滿面的照片，讀到她交回獎牌，還會 鋃鐺入獄的消息，不知為何，并不因此而十分憎恨、厭惡她， 反倒涌動著些許同情,

12、5枚奧運獎牌得主、美國“女飛人”瓊斯,欺騙之后是良心的折磨，悔恨的淚水只是對犯罪的懺悔，卻不能洗刷掉對奧運精神的玷污，監(jiān)獄將成為瓊斯完成自我救贖的驛站,據(jù)日本共同社報道，國際柔道聯(lián)盟(IJF)7日在突尼斯舉行理事會， 正式?jīng)Q定對在2009年8月荷蘭世錦賽上藥檢結果呈陽性的北京奧運 會柔道女子78公斤以上級冠軍佟文處以2年禁賽處罰，禁賽期至 2019年9月結束。佟文蟬聯(lián)三屆世錦賽冠軍時所獲金牌將被取消， 但亞軍及以下名次不會順位上升,佟文的恩師、教練吳衛(wèi)鳳。“她（佟文）應該是無意中吃了 含有大量瘦肉精的排骨才造成這樣的后果。,許多化學物質(zhì)被稱為瘦肉精，主要有萊克多巴胺、鹽酸克侖特羅(腎上腺類神經(jīng)

13、興奮 )、 沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特羅、鹽酸多巴胺等7種。其中培林 （雷托巴胺，萊克多巴胺 ，Ractopamine）毒性極低、代謝快速（無累積性）， 因此被美國等國家允許添加入豬飼料，日本也允許使用培林（Ractopamine） 的豬肉進口。目前全世界有美國等24國開放使用培林，有160多國仍禁用,瘦肉精,To be or not to be,作用于神經(jīng)系統(tǒng)以增強體力的刺激劑，如苯丙胺、麻黃堿、咖啡因、可卡因等42種； 能產(chǎn)生快感和心理亢奮而降低痛感的麻醉劑，該類藥物多有成癮性，如哌替啶、嗎啡等19種； 具有鎮(zhèn)靜作用而抑制支氣管及血管平滑肌舒張的-阻斷劑，如比索洛爾、梭達

14、羅等9種； 用以增加腎臟對尿的排泄速率使禁用藥物在尿液中不易檢出的利尿劑，如依他尼酸、芐氟噻嗪米等15種,第17頁,IOC規(guī)定的興奮劑可分為下述七類,5. 用以遮蔽檢測重要性生理指標的掩蔽劑，如表睪酮等4種； 6. 用以增長肌肉和逆轉(zhuǎn)蛋白損失的合成類固醇，常見的有氯睪酮、達那唑、大力補、美雄酮等16種雄性激素衍生物； 7. 增強體內(nèi)紅細胞數(shù)目并提高血液載氧能力的肽類激素（內(nèi)源性），包括紅細胞生成素（EPO）、絨毛膜促性腺激素（HCG）、生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素等4種,第18頁,第19頁,1、興奮劑檢測的基本要求與分析步驟,1）違禁藥物在體內(nèi)含量低； （2）違禁藥物在體內(nèi)代謝復雜，且有個體差異

15、； （3）違禁藥物在體內(nèi)本身有，需檢測內(nèi)源性與外源性； （4）違禁藥物不斷出現(xiàn),興奮劑檢測任務困難、艱巨，原因,第20頁,興奮劑檢測的總體要求,樣品的預處理及分離、富集技術應簡潔，盡可能保留待 檢出的所有成分； 分析方法在保證單一成分檢測準確的同時，應盡量擴展檢測 范圍并使之能同時檢出多種成分； 檢測方法對檢測物的靈敏度要高； 儀器檢測方面宜發(fā)展高效分離和檢測低限的檢測技術,第21頁,樣品的類型主要有三種：即尿樣、血樣和發(fā)樣,尿樣是興奮劑檢測中最常用的手段，其主要原因 為取樣容易、預處理簡單、尿中藥物及其代謝產(chǎn)物 濃度高于血中，樣品易于保存,血檢的優(yōu)點在于可以檢測出尿樣無法檢出的促紅 細胞生長

16、因子（EPO）等物質(zhì),發(fā)檢可提供濫用者服用禁藥數(shù)月之后的證據(jù),Doping control,取樣 賽后1h，名次、隨機 A、B樣,預處理 A樣多份，酸、 堿、酶化,組篩選 陰、陽,確證和復審 陽性、重檢,第22頁,2、興奮劑檢測的一般技術 興奮劑樣品時一個復雜體系，它不僅存在正 常食物引入的化學/生物物質(zhì)和嫌疑外源性違禁 物，同時也含有人體正常生理過程的分泌/代謝 產(chǎn)物-內(nèi)源性物質(zhì)。因此，興奮劑樣品分離效 率、監(jiān)測方法的靈敏度是影響檢測結果可靠性 的關鍵因素,第23頁,分離方法 主要依靠色譜法： GC、TLC、HPLC和MEKC。 檢測器 興奮劑的濃度很低，檢測器的靈敏度是重 要依據(jù)。色譜法中

17、先后采用氫焰離子化檢測器 （FID）、氮磷檢測器（NPD）和質(zhì)譜檢測技 術,第24頁,GC-MS一直是IOC進行興奮劑檢測的最有力工 具之一。目前普遍采用質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用（MS/MS）、 高分辨質(zhì)譜（HRMS）和多離子檢測等技術。這 些方法成功檢測2ng/ml的康力龍、克倫特羅、 5-4-羥基甲睪等興奮劑,第25頁,3、內(nèi)源性激素的檢測與策略,第26頁,刺激劑、合成類固醇、-阻斷劑等傳統(tǒng)興 奮劑檢測方法已近完善，但一些內(nèi)源性激素成 為興奮劑檢測的難點。如睪酮（T）、雙氫睪酮 （DHT）、EPO和人體生長激素（HGH）等,T的檢測,第27頁,正常男性體內(nèi)，內(nèi)源T與表睪酮（ET）的比 為30，而尿中排出的T/ET為1,如使用外源性T， T ，E