分子生物學(xué)實驗理論考試

1、.2012-2013學(xué)年第二學(xué)期分子生物實驗考試題庫1、 PCR原理是什么？答：PCR技術(shù)是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它的特異性是由兩個人工合成的引物序列決定。引物就是與待擴增DNA片段兩側(cè)互補的寡核苷酸。雙鏈DNA是在臨近沸點的溫度下加熱時便會分離成兩條單鏈DNA分子（變性），兩引物分別與兩條DNA的兩側(cè)序列特異復(fù)性，在適宜條件下，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸，在引物的引導(dǎo)下，按53方向復(fù)制互補DNA，即引物的延伸。在適宜的條件下，這種熱變性復(fù)性延伸的過程不斷循環(huán)重復(fù)，前一個循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一個循環(huán)的模板DNA參與DNA合成

2、，使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴增。2、 PCR一般體系應(yīng)加入哪些試劑？答：10*PCR緩沖液（含Mg+）、模板DNA、四種dNTP、一對引物、耐熱Taq聚合酶。3、 PCR防止其它DNA污染，應(yīng)注意哪些問題？答：標(biāo)本放置時密封要嚴(yán)避免溢于容器外，容器要清潔避免造成相互間交叉污染；移液器使用要規(guī)范避免污標(biāo)本間污染;無菌工作臺操作，避免氣體中有雜菌。4、 影響PCR產(chǎn)物產(chǎn)量的因素主要有哪些？答：引物、酶的種類及濃度、dNTP的質(zhì)量（優(yōu)劣）與濃度、模板核酸的量與純化程度、Mg2+濃度、溫度與時間、循環(huán)次數(shù)。5、 引物設(shè)計應(yīng)注意哪些問題？答：引物長度不宜過長20bp左右較佳；引物擴增片段的長度以200

3、-500為宜；引物堿基的中G+C的含量應(yīng)在40-60%為宜，G+C太少則擴增效果不佳，G+C過多則易出現(xiàn)非特異條帶；避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩天引物間互補，特別是3端的互補否則會形成二聚體結(jié)構(gòu)；引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。6、 簡述克隆某一原核生物基因片段一般操作步驟？答：克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技術(shù)對基因進行大量擴增，首先準(zhǔn)備好實驗材料大體為：需擴增的模板DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR緩沖液、引物等、其過程大體分為3個步驟：第一步：變形：通過加熱使DNA模板雙螺旋鏈解離為單鏈，第二步：退火

4、：當(dāng)溫度突然降低時。由于模板DNA結(jié)構(gòu)復(fù)雜難再互補，而引物建構(gòu)簡單且數(shù)量巨多易于模板DNA互補雜交從而使引物結(jié)合到模板上DNA上，第三部：延生：在DNA聚合酶和四種底物及鎂離子存在條件下DNA連開始延伸。以上3個步驟為一個循環(huán)，數(shù)小時后即可得到大量擴增的目的片段。7、 什么是質(zhì)粒？質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些？答：a質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。b具有復(fù)制起點。攜帶易于篩選的選擇標(biāo)記。具有多種限制性內(nèi)切酶的切割位點

5、。具有較小的相對分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。8、 質(zhì)粒抽提實驗中溶液I、II、III各有什么作用？答：溶液I:由葡萄糖,EDTA,Tris Cl組成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒DNA;EDTA的作用是絡(luò)和掉Mg2+等二價金屬離子,防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用;Tris Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍。 溶液II:由SDS與NaOH組成.SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性;NaOH(pH12)的作用是破壞氫鍵,使DNA分子變性。溶液III:由KAc與HAc組成,是pH值為5.5的高鹽溶液.能中和溶液II的堿性,使染色體DNA

6、復(fù)性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DNA復(fù)性.K+離子會與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去.溶液中的染色體DNA也會與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì),很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離,此外,高鹽溶液也有利于各種沉淀的形成。9、 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA的基本原理是什么？答：堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA之間在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而達到分離目的。PH介于12.012.5時，線性DNA變性，雙鏈打開，而質(zhì)粒DNA雖變性，但兩條互補鏈彼此纏繞，當(dāng)PH恢復(fù)到中性時，質(zhì)粒DNA可迅速準(zhǔn)確的完成復(fù)性，而線性DNA復(fù)性較困難，纏繞成網(wǎng)狀，通過離心可沉淀除去。10、 在堿裂解法提取質(zhì)粒DNA操

7、作中應(yīng)注意哪些問題？答：（1）正確使用移液器。（2）溶液ll必須新鮮配制。（3）加入酚-氯仿后必須充分混勻。（4）混勻的過程不能太過劇烈。（5）每次棄上清液時都應(yīng)用移液器吸去管壁上黏附的水珠。（6）吸取酚-氯仿溶液時要將Tip頭插入液體分層的下側(cè)?！究筛鶕?jù)第一次試驗自己寫的注意事項進行補充】11、在堿裂解法提取質(zhì)粒DNA時， 酚/氯仿的作用是什么？答：酚是強烈的蛋白質(zhì)變性劑，能有效使蛋白質(zhì)變性而除去，氯仿有強烈的脂溶性，去除脂類雜質(zhì)，本身酚：氯仿：異戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白質(zhì)12、 堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA分子一般有幾種構(gòu)象？電泳時移動速率有何差異？答：超螺旋DNA線性DNA開

8、環(huán)DNA13、 提取植物基因組DNA的基本原理是什么？在操作過程中應(yīng)該注意什么？答：基本原理:利用液氮對植物組織進行研磨，從而破碎細(xì)胞。細(xì)胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經(jīng)異丙醇沉淀。注意事項:材料要新鮮嬌嫩，葉片研磨地越細(xì)越好；操作應(yīng)為無菌操作；操作應(yīng)溫和，不宜劇烈晃動；注意移液器的正確使用。14、 在植物基因組提取過程中，DNA 降解的可能原因？答：原因:從植物中提取DNA時沒對細(xì)胞內(nèi)的DNA酶進行滅活；操作過程中被細(xì)菌污染了；口水等含酶物質(zhì)飛入樣品中；溫度、PH等變化過于劇烈

9、。15、 在植物基因組提取過程中，提高 DNA 產(chǎn)量的措施？答：應(yīng)當(dāng)選取幼嫩的葉片，因為幼嫩葉片中的DNA含量高些；組織抽提前要保存在液氮中，以免DNA被破壞；純化時注意抑制核酸酶污染，使用EDTA等防止DNA降解；整個實驗過程應(yīng)該溫和操作，不能劇烈振蕩，混合過程要輕緩，減少抽提，減少DNA片段被認(rèn)為降解，因為過度振蕩會使DNA斷裂成小片段。16、 在使用苯酚進行DNA提取時應(yīng)該注意什么？答：酚一定要進行堿平衡，苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜、眼睛會對人體造成損傷，應(yīng)當(dāng)注意防護；它是出去蛋白質(zhì)的，要充分振蕩使蛋白質(zhì)變性，但不能太劇烈而打斷DNA；離心后應(yīng)該避免再次吸入有機相的苯酚氯仿，盡

10、量只取上清，不應(yīng)該讓苯酚最后仍有殘留，需抽提干凈。17、 在提取植物基因組DNA過程中，使用苯酚與氯仿的作用是什么？答：用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保證提取的基因組較純凈。18、 在植物基因組提取過程中，該如何檢測和保證基因組DNA的質(zhì)量？答：檢測：瓊脂糖凝膠電泳；保證DNA活性:用EDTA抑制DNA酶活性，從而保證DNA不被破壞。19、 什么是限制性內(nèi)切酶？答：限制性內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶，有三種類型，類，類，類，他們都有甲基化修飾功能和限制酶功能，類常用于分子克隆20、 常見的型限制性內(nèi)切酶切割雙鏈DNA后會產(chǎn)生

11、 末端或 末端。答：粘性，平21、下列有關(guān)限制性內(nèi)切酶的描述，錯誤的是：（C）A一種限制性內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列B限制性內(nèi)切酶的活性受溫度的影響C限制性內(nèi)切酶能識別和切割RNAD限制性內(nèi)切酶可以從原核中提取22、 現(xiàn)有一長度為l 000 bp的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I酶切后得到的DNA分子仍是l 000 bp，用Kpn I單獨酶切得到400 bp和600 bp 2種長度的DNA分子用EcoR I，Kpn l同時酶切后得到200 bp和600 bp 2種長度的DNA分子。請畫出該DNA可能的酶切圖譜。答：這是個大小為1000bP的環(huán)形的DNA分子，在1bP處和4

12、00bP處分別有一個Kpn 位點，在200bP處有一個EcoR 位點。23、一個限制性內(nèi)切酶的識別序列和切割位點是5一GGATCC一3，在質(zhì)粒上有該酶的一個切點，請畫出質(zhì)粒被該限制性內(nèi)切酶切割后所形成的黏性末端。答：-G GATCC-寫在上面，下面為-CCTAG G- 該酶為限制性內(nèi)切酶I24、基因工程中，切割目的基因和載體所用的限制酶及切口必備的特點是(A)A可用不同的限制性內(nèi)切酶，露出的黏性末端必須相同B必須用相同的限制性內(nèi)切酶，露出的黏性末端可不相同C必須用相同的限制性內(nèi)切酶，露出的黏性末端必須相同D可用不同的限制性內(nèi)切酶，露出不同的黏性末端25、在遺傳工程技術(shù)中，限制性內(nèi)切酶主要用于（

13、D）A. 目的基因的提取和導(dǎo)入B. 目的基因的導(dǎo)入和檢測C. 目的基因與運載體結(jié)合和導(dǎo)入D. 目的基因的提取和與運載體結(jié)合26、 在分子生物學(xué)實驗中，常使用微量移液器，請說明在使用微量移液器時需要注意什么？答：確定合適的量程，不可超過量程取液。取液時按到第一檔，Tip頭垂直進入液面3-5毫米取液。移液器注意不能接觸溶液。打出液體時貼壁并有一定角度，要按到第二檔將液體全部壓出。使用完畢后，打下tip頭，放好移液器。27、 現(xiàn)有量程為0.1-2.5 l；1-10 l；2.5-20 l；10-200 l；100-1000 l的移液器各一支，請問，當(dāng)吸取0.15 l，0.5 l，5 l，15 l，10

14、0l，750 l液體時，各需要選取那種最佳量程范圍的移液器？答：分別是0.1-2.5 ，0.1-2.5 ，1-10， 2.5-20， 10-200， 100-1000。28、 本學(xué)期我們學(xué)習(xí)了CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和熱休克法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA，你還知道哪些方法可以制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的方法？答：氯化銣法，甘油聚乙二醇法，一步法 29、 在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，是如何進行篩選的？答：因為質(zhì)粒pETBlue-2帶有青霉素抗性基因,所以轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌細(xì)胞能在含羧芐青霉素的瓊脂糖平板上生長形成菌落.所以用含羧芐青霉素的瓊脂糖平板可以篩選出轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌。30、 藍白班篩選的

15、原理是什么？答：見實驗指導(dǎo)92面的實驗原理的后半部分31、 在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞時，如果將用來浸泡玻璃棒的酒精引燃起火該如何處理？答：用水打濕的毛巾，著火時用毛巾蓋上就行了32、 衛(wèi)星菌落出現(xiàn)的原因是什么？該如何避免？答：衛(wèi)星菌落是氨芐降解后生長的雜菌 ?？赡苁歉惺軕B(tài)細(xì)胞的問題也可能是轉(zhuǎn)化過程出現(xiàn)操作失誤例如未在冰中進行轉(zhuǎn)化，感受態(tài)在常溫下放置過久失活，轉(zhuǎn)化后搖菌時間過短，或者搖床速度過慢，沒有把菌搖起來，如果不是轉(zhuǎn)化過程出現(xiàn)的問題就要進一步考慮連接是否正確，連接時間1216h，體系一般6ul-10ul，目的片段：載體一般1:31:10?？梢詫⑴囵B(yǎng)時間控制在12h-16h之間 ，

16、或者更換抗生素為羧芐青霉素。33、 影響所制備感受態(tài)效率的因素有哪些？答：影響因素有（1）大腸桿菌生長狀態(tài)（2）氯化鈣濃度（3）冰上放置時間（4）保存溫度34、轉(zhuǎn)化后為什么要溫育1小時？為什么加入的是無抗培養(yǎng)基？答：第一問：溫育就是讓感受態(tài)恢復(fù)一下狀態(tài)，以及一些相關(guān)抗性基因的表達。畢竟從-70環(huán)境中取出，需一段時間適應(yīng)才可轉(zhuǎn)化。第二問：因為細(xì)胞比較脆弱，加無抗培養(yǎng)基是為了讓細(xì)胞生長，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新表型得到表達。35、 如果實驗中對照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現(xiàn)象？答：（1）操作過程儀器、器皿等不是無菌的，出現(xiàn)了一些雜菌和雜DNA 的污染 （2）細(xì)菌在感受

17、態(tài)時發(fā)生了一些自然變異，對所加的抗生素有一定的抗性，所以長出一些菌落 （3）所加的抑菌抗生素濃度不夠，不能夠抑制住細(xì)菌的生長 （4）一些實驗誤差，錯將菌液放錯36、在轉(zhuǎn)化實驗中，實驗組和對照平皿應(yīng)有什么樣的結(jié)果？如何解釋這個結(jié)果？答：實驗組中長出菌落 而對照組中無任何菌落生長。37、 在學(xué)習(xí)制備感受態(tài)細(xì)胞時，為什么要保證細(xì)胞密度108/ ml？甘油的作用是什么？答：細(xì)胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為宜，密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率，一次要保證細(xì)胞密度108/ ml。甘油的目的是為了防止水在凍結(jié)過程中產(chǎn)生過大的冰晶損傷細(xì)胞，抑制大腸桿菌生長，以便保存。38、 通過分子生物學(xué)實驗，你認(rèn)為自己掌握

18、了哪些實驗技能？你對分子生物學(xué)實驗有哪些建議與意見？答：此為主觀題，可結(jié)合所學(xué)知識發(fā)揮，言之有理即可。（比如凝膠電泳，PCR擴增等。）這門課程將分子生物學(xué)實驗操作的理論與實踐相結(jié)合，不僅使我在分子生物學(xué)實驗技能方面得到系統(tǒng)的訓(xùn)練，而且讓我對具體實驗操作的原理有了清晰地認(rèn)識。作為一門實驗課，它還鍛煉了我運用已學(xué)到的理論知識和已掌握的實驗技能綜合解決科學(xué)問題的能力。39、用瓊脂糖凝膠分離DNA的理論依據(jù)是什么？答：DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負(fù)電，在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以相同的速率向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的