牛Mx1基因抗口蹄疫病毒作用及其抗病分子機(jī)制的研究

1、牛 Mx1基因抗口蹄疫病毒作用及其抗病分子機(jī)制的研究口蹄疫 (Foot-and-mouth disease,FMD)是由 FMD病毒 (FMDV)引起的牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物發(fā)生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。由于FMDV變異快、血清型多 , 通過疫苗免疫單一手段難以有效防控。因此 , 需要探索包括天然免疫在內(nèi)的多種途徑, 綜合防控口蹄疫。天然免疫特別是抗病毒基因是阻止病毒感染的第一道防線。病毒入侵宿主細(xì)胞后 , 病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素 (IFN),I-IFN和 III-IFN在抗病毒感染的先天免疫過程中發(fā)揮重要的作用, 能啟動(dòng)、激活Mx(Myxovirus-resistant)等抗病毒通路。研

2、究表明,Mx 蛋白可直接作用于多種RNA病毒和 DNA病毒 , 具有天然的抗病毒功能, 在天然免疫研究領(lǐng)域具有十分重要的地位。然而 , 牛 Mx1抗 FMDV作用尚不清楚。本研究利用過表達(dá)和基因沉默技術(shù), 發(fā)現(xiàn)牛 Mx1具有抗 FMDV活性 , 并從牛 Mx1對(duì) FMDV基因組 RNA復(fù)制及其作用病毒蛋白兩個(gè)層面探討了牛Mx1抗 FMDV的分子機(jī)制 , 主要試驗(yàn)結(jié)果如下 :1. 建立牛 Mx1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 BHK21-Mx1,免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證牛Mx1在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá) , 牛 Mx1具有抗 FMDV活性。利用 RT-PCR方法擴(kuò)增到牛 Mx1基因 , 構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Mx1,真

3、核表達(dá)的 Mx1蛋白帶有 Flag 標(biāo)簽 ;pcDNA3.1-Mx1 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞 , 瞬時(shí)表達(dá)量高 ; 再將 pcDNA3.1-Mx1和空載 pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染 FMDV的易感細(xì)胞 BHK-21,經(jīng) G418篩選 , 獲得單克隆細(xì)胞 , 對(duì)克隆細(xì)胞進(jìn)行半跨越 PCR、 Western blot 鑒定 , 篩選出高表達(dá)牛 Mx1的克隆 , 經(jīng)傳代 60d 以上 , 仍保持 Mx1高表達(dá)狀態(tài) , 獲得穩(wěn)定表達(dá)牛 Mx1的細(xì)胞系 BHK21-Mx1及對(duì)照細(xì)胞 BHK21-3.1; 利用 Flag 單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色 , 牛 Mx1蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi) ; 將穩(wěn)定表達(dá)牛 Mx1細(xì)

4、胞系 BHK21-Mx1感染FMDV,48h內(nèi)能抵御 FMDV 100TCID50的攻擊 ,BHK21-Mx1的細(xì)胞病毒液的 TCID50比對(duì)照組 BHK21-3.1 降低 10 倍以上。結(jié)果表明 , 牛 Mx1可抑制 FMDV的復(fù)制與增殖 , 牛 Mx1具有抗 FMDV功能。2. 利用 FMDV天然易感細(xì)胞模型 , 建立沉默牛 Mx1的牛胎兒原代氣管上皮細(xì)胞 ,反向驗(yàn)證了牛 Mx1具有抗 FMDV功能。針對(duì)牛 Mx1基因編碼區(qū) , 設(shè)計(jì)、合成 shRNA引物 , 構(gòu)建慢病毒 H1 重組載體 ; 將構(gòu)建的 shRNA重組載體分別與pcDNA3.1-Mx1載體共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞 ,Weste

5、rn blot檢測(cè)牛 Mx1的表達(dá) , 篩選出對(duì)牛 Mx1干擾效率最高的載體 ; 再轉(zhuǎn)染牛胎兒原代氣管上皮細(xì)胞, 經(jīng)流式細(xì)胞分選 , 獲得 GFP陽性細(xì)胞 , 有限稀釋法培養(yǎng)細(xì)胞 , 對(duì)培養(yǎng) 10d 以上的表達(dá) GFP的克隆細(xì)胞 , 進(jìn)行 PCR和Western blot檢測(cè) , 獲得沉默牛 Mx1的細(xì)胞 BTPE-siMx1及對(duì)照細(xì)胞 BPTE-LacZ;利用熒光定量 RT-PCR方法 , 確定牛胎兒原代氣管上皮細(xì)胞的-IFN 誘導(dǎo)終濃度 1 104IU/ml 、誘導(dǎo)時(shí)間為 6h, 牛 Mx1表達(dá)量最高 ; 進(jìn)行 100TCID50的 FMDV感染 ,發(fā)現(xiàn)沉默 Mx1細(xì)胞系 BPTE-siM

6、x1 培養(yǎng)物的 FMDV滴度顯著高于對(duì)照細(xì)胞BPTE-LacZ。結(jié)果表明 , 沉默牛 Mx1促進(jìn)了 FMDV的增殖 , 從反向驗(yàn)證了牛Mx1具有抗 FMDV功能。 3. 建立 FMDV鏈特異性熒光定量RT-PCR(ssqRT-PCR)檢測(cè)方法 , 對(duì) FMDV基因組 RNA定量分析 , 發(fā)現(xiàn)牛 Mx1能抑制 FMDV基因組 RNA的復(fù)制。通過比對(duì) FMDV基因組序列 , 確定保守的基因序列 , 引入非病毒的標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)分別擴(kuò)增 FMDV正鏈和負(fù)鏈 RNA引物 , 建立了 FMDV ssqRT-PCR熒光定量檢測(cè)方法 , 具有較好的靈敏性、特異性、重復(fù)性; 在 FMDV感染 8h、16h、24h

7、 后, 過表達(dá)牛 Mx1細(xì)胞 BHK21-Mx1的正鏈 RNA拷貝數(shù)比對(duì)照細(xì)胞BHK21-3.1 高 20 倍、34 倍和 22 倍, 同時(shí) BHK21-Mx1細(xì)胞的負(fù)鏈 RNA拷貝數(shù)比對(duì)照細(xì)胞 BHK21-3.1 高為 12倍、19 倍和 17 倍; 而牛 Mx1沉默細(xì)胞 BPTE-siMx1 正鏈 RNA的拷貝數(shù)比對(duì)照細(xì)胞BPTE-Lac Z 高 29 倍、 47 倍和 14 倍 , 同時(shí) BPTE-siMx1 細(xì)胞的負(fù)鏈 RNA的拷貝數(shù)比對(duì)照細(xì)胞 BPTE-LacZ高為 24 倍、32 倍和 14 倍。結(jié)果表明 , 牛 Mx1可抑制 FMDV基因組 RNA的復(fù)制。4. 原核表達(dá) FMDV

8、的 P1、P2、 P3 蛋白 , 制備兔抗血清 ,Western blot檢測(cè)到在牛 Mx1作用下 2C蛋白量降低 ; 利用 GST pull-down 和免疫共沉淀方法 , 確認(rèn)牛Mx1可作用于 FMDV2C 蛋白的 N端, 發(fā)揮抗病毒功能。成功構(gòu)建了 FMDV的 P1、P2、P3 基因的 pET32a原核表達(dá)載體 , 并純化到相應(yīng)的蛋白 , 制備了兔多克隆抗體 ;Western blot 技術(shù)檢測(cè) ,FMDV感染牛 Mx1穩(wěn)定細(xì)胞系 BHK21-Mx1的細(xì)胞培養(yǎng)物 , 與對(duì)照細(xì)胞相比 ,2C 蛋白量顯著降低 ; 成功構(gòu)建了帶有 GST標(biāo)簽的牛 Mx1和 2C的原核表達(dá)載體 , 并純化到相應(yīng)蛋白 , 通過 GST pull-down 實(shí)驗(yàn) , 表明牛 Mx1可與FMDV2C 結(jié)合 ; 成功構(gòu)建了帶有HA標(biāo)簽