免疫學(xué) 沉淀反應(yīng)

1、第,5,章,沉淀反應(yīng),Precipitation,沉淀反應(yīng),可溶性,抗原和抗體特異性結(jié)合，在,適當(dāng)條件下形成沉淀物的現(xiàn)象，包括液相沉,淀試驗(yàn)和凝膠沉淀試驗(yàn),主要內(nèi)容,液相沉淀反應(yīng),凝膠中沉淀反應(yīng),免疫濁度分析,第一節(jié),液相沉淀試驗(yàn),液相沉淀反應(yīng),fluid phase precipitation,指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含電解質(zhì)的液,體介質(zhì)中反應(yīng)，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物,液相內(nèi)沉淀分為,絮狀沉淀試驗(yàn),環(huán)狀沉淀試驗(yàn),免疫濁度分析,一、絮狀沉淀試驗(yàn),一,基本原理,可溶性,抗原,與相應(yīng),抗體,在有,電解質(zhì),存在的條件,下，形成可見(jiàn)的絮狀沉淀物,方法：玻片法和試管法,方法簡(jiǎn)單,不需特殊設(shè)備,靈敏低,已被

2、其它方法取代,二,環(huán)狀沉淀試驗(yàn),一,基本原理,將抗原溶液疊加在細(xì)小玻璃管中抗體溶液上,面，抗原與抗體在兩液交界面處特異性結(jié)合,形成白色沉淀環(huán),絮狀沉淀試驗(yàn),方法簡(jiǎn)單，不需特殊設(shè)備,但敏感度較低，已其他方法被取代,第二節(jié),凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn),gel phase precipitation,凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn),可溶性抗原與相應(yīng)抗體分別放入凝膠內(nèi)進(jìn),行擴(kuò)散，二者在比例合適的位置形成肉眼可,見(jiàn)的沉淀線或沉淀環(huán)，又稱凝膠擴(kuò)散,gel,diffusion,凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)分為,自由擴(kuò)散,單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),定向擴(kuò)散,火箭電泳,對(duì)流免疫電泳,定向,自由擴(kuò)散,免疫電泳,免疫固定電泳,一、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

3、,single immunodiffsion,一）基本原理,待測(cè)抗原從局部含有相應(yīng)定量抗體的凝膠,內(nèi)自由向周?chē)鷶U(kuò)散，抗原抗體特異性結(jié)合,在二者比例合適的部位，形成白色沉淀環(huán),沉淀環(huán)大小與抗原的濃度成正相關(guān),二）技術(shù)要點(diǎn),制板：將抗體和熱融化瓊脂混合，傾注成平板,打孔,加樣：待測(cè)抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品,反應(yīng)：置37,24,48h,后觀察孔周?chē)恋憝h(huán),三,數(shù)據(jù)處理,1,Mancini,曲線,適用于,大,分子抗原，如,IgM,測(cè)定，擴(kuò)散,時(shí)間,48h,2,沉淀環(huán)直徑的平方,d,與抗原濃度,C,呈線性,關(guān)系,2,Fahey,曲線,適用于,小,分子抗原,擴(kuò)散,時(shí)間,較短,24h,抗原濃度的對(duì)數(shù),log c,與

4、沉淀環(huán)直徑,d,呈,線性關(guān)系,四,臨床應(yīng)用,用于,IgG,IgA,IgM,C3,C4,等定量測(cè)定,簡(jiǎn)單、特異，但敏感性低，已被其它方法取代,二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),double immunodiffusion,一）基本原理,將抗原和抗體溶液分別放在凝膠不同,的對(duì)應(yīng)孔中，讓兩者均在凝膠中自由擴(kuò),散，當(dāng)抗原與抗體相遇，濃度比例適當(dāng),處形成可見(jiàn)的白色沉淀線,二）技術(shù)要點(diǎn),瓊脂傾注制板,待瓊脂凝固后，在瓊脂膠板上打孔,在相對(duì)的孔中分別加入抗原或抗體,置室溫或,37,18,24h,觀察沉淀線,三）方法評(píng)價(jià),方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便的方法，不需特別儀器設(shè),備，重復(fù)性好，但靈敏度稍差,1.25mg/L,四）臨床應(yīng)用,1

5、,血清學(xué)診斷,出現(xiàn)沉淀線，表明存在相應(yīng)的,Ag,或,Ab,2,免疫化學(xué)分析,濃度、分子量、純度、反應(yīng)性,沉淀線靠近抗原孔，提示抗體含量高；反之則反,出現(xiàn)多條沉淀線，則說(shuō)明抗原和抗體皆不是單,一成分?？捎糜阼b定抗原或抗體的純度,在瓊脂內(nèi)擴(kuò)散的速度受分子量的影響,如分子量大時(shí)，沉淀線彎向分子量大的一邊,如二者分子量相等，則形成直線,用于抗原性質(zhì)的分析,分析兩種受檢抗原的性質(zhì)是,完全相同,部分相同或,完全不同,3,用于抗體效價(jià)的滴定,固定抗原的濃度，稀釋抗體，經(jīng)過(guò)自,由擴(kuò)散，形成沉淀線，出現(xiàn)沉淀線的最高,抗體稀釋度為該抗體的效價(jià),二、定向免疫擴(kuò)散,在電場(chǎng)作用下，抗原抗體在介質(zhì)中發(fā)生定向,移動(dòng)的沉淀反

6、應(yīng),定向、加速擴(kuò)散,分類,火箭免疫電泳,rocket immunoelectrophoresis,對(duì)流免疫電泳,counter immunoelectrophoresis,一,對(duì)流免疫電泳,對(duì)流免疫電泳,是雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合，在電場(chǎng)中加速定,向擴(kuò)散的雙向免疫擴(kuò)散技術(shù),1,基本原理,在,pH8.6,的瓊脂凝膠中,大部分蛋白質(zhì)抗原在堿性溶液中帶負(fù)電荷，且,分子較小，電泳時(shí)，泳向正極,抗體帶弱負(fù)電荷，但分子量大，電泳力小于電滲,力，泳向負(fù)極,抗原和抗體相遇，比例合適時(shí)形成肉眼可見(jiàn),的沉淀線,2,技術(shù)要點(diǎn),制板，在瓊脂板上成對(duì)打孔，加抗原和抗體,電泳后觀察結(jié)果,3,方法評(píng)價(jià),操作簡(jiǎn)便,靈敏度較高

7、，比雙擴(kuò)高約,10,倍,分辨率低于雙擴(kuò),4,臨床應(yīng)用,常用于抗原或抗體的定性分析、效價(jià)測(cè)定和純度鑒,定等,二,火箭免疫電泳,火箭免疫電泳,是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合，在電場(chǎng)中,加速定向擴(kuò)散的單向免疫擴(kuò)散技術(shù)，由于其沉淀形,似火箭，故稱為火箭電泳,1,基本原理,電泳與反應(yīng),抗原在電場(chǎng)作用下，在含有適量抗體,的凝膠中向正極泳動(dòng)，逐漸形成梯度濃度，在抗原,抗體比例適當(dāng)時(shí)形成沉淀，隨著抗原量的減少，沉,淀帶越來(lái)越窄，形成火箭峰樣沉淀帶，峰形高低與,抗原量呈正相關(guān),結(jié)果分析,用已知量標(biāo)準(zhǔn)抗原作對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲,線，根據(jù)檢測(cè)樣品沉淀峰的高度可算出待測(cè)抗原的,含量,2,技術(shù)要點(diǎn),制板與打孔,電泳,樣品孔側(cè)

8、置負(fù)極電泳,結(jié)果,電泳完畢，觀察瓊脂板上沉淀峰，測(cè)量,從孔,中心到峰尖的高度,計(jì)算,以峰高為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo),對(duì)數(shù),坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待檢樣品抗原濃度,3,方法評(píng)價(jià),操作簡(jiǎn)便,靈敏度較高,mg/L,4,臨床應(yīng)用,1,抗原蛋白定量，如,IgA,IgG,IgM,和,sIgA,檢測(cè),2. C3,C4,及其裂解產(chǎn)物檢測(cè),3. AFP,等檢測(cè),已被免疫濁度分析取代,三、定向自由擴(kuò)散,是將區(qū)帶電泳與免疫擴(kuò)散相結(jié)合的免疫化學(xué),分析技術(shù),一,免疫電泳,immunoelectrophoresis,IEP,免疫電泳,是將區(qū)帶電泳與雙向免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一,種免疫化學(xué)分析技術(shù),1,基本原理,電泳,Ag,

9、在凝膠上進(jìn)行電泳，被分離成不同區(qū)帶,反應(yīng),在,停止電泳后，在與電泳方向平行挖一條,形槽，加入相應(yīng)抗血清，使抗原和抗體呈雙向擴(kuò),散，在二者比例合適處形成肉眼可見(jiàn)的弧形沉淀,線,根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，可分析、鑒,定樣品中所含抗原成分及其性質(zhì),2,技術(shù)要點(diǎn),制板與打孔,加樣,加入待檢抗原標(biāo)本或正常血清對(duì)照,電泳,抗原一端接陰極，電泳,1.5,2h,反應(yīng),挖一小槽，向槽內(nèi)加入抗體，使抗原抗,體雙向擴(kuò)散,觀察結(jié)果,放置,24h,后，觀察沉淀線的數(shù)目,形狀和位置,3,方法評(píng)價(jià),主要優(yōu)點(diǎn),特異、分辨率高,4,臨床應(yīng)用,主要用于,純化抗原或抗體的成分分析,異常體液中蛋白質(zhì)分析，如無(wú)丙種球蛋白血,癥、白

10、血病等病人的血清蛋白成分的分析,二,免疫固定電泳,immunofixation electrophoresis,區(qū)帶電泳與,免疫沉淀,反應(yīng)相結(jié)合的免疫分析,技術(shù),一）原理,似免疫電泳，不同之處是電泳后,直接將抗,體作,用于被分離的各組分蛋白質(zhì)，抗,Ag-Ab,發(fā),生反應(yīng)，使,Ag,在電泳位置上被免疫固定,2,技術(shù)要點(diǎn),電泳,先將抗原作區(qū)帶電泳，分離成不同區(qū)帶,沉淀反應(yīng),電泳后，將,Ab,加于蛋白質(zhì)區(qū)帶表面,Ag,與,Ab,發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成的,CIC,嵌于固相支持物中,洗去游離的,Ag,或,Ab,顯示出被結(jié)合固定的某種蛋白質(zhì),3,方法評(píng)價(jià),簡(jiǎn)便、快速,靈敏度高于免疫電泳,4,臨床應(yīng)用,可用于鑒

11、定具有近似遷移率的多種蛋白,如各種,M,蛋白、補(bǔ)體的裂解產(chǎn)物、免疫球蛋白的,輕鏈型別,腦脊液、尿液或其他體液中微量蛋白的檢測(cè)與,鑒定,第三節(jié),免疫濁度分析技術(shù),immunoturbidimetry,免疫濁度測(cè)定,是將液相內(nèi)的,沉淀試驗(yàn),與,現(xiàn)代光學(xué)儀器,和,自動(dòng),分,析技術(shù)相結(jié)合的一項(xiàng)分析技術(shù),當(dāng),可溶性抗原,與相應(yīng)的抗體特異結(jié)合，可以形成不,溶性的,CIC,使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。用儀器檢測(cè)濁度,推算出復(fù)合物的量,免疫濁度測(cè)定按測(cè)量方式分為,透射免疫比濁法,turbidimetric immunoassay,或,turbidimetry,散射免疫比濁法,nephelometric immunoas

12、say,或,nephelometry,一、透射免疫比濁法,transmission turbidimetry,一,基本原理,抗原抗體結(jié)合后形成的,CIC,引起液體介質(zhì)出,現(xiàn)濁度改變，光線的透過(guò)量減少，被吸收,光線量與,CIC,形成量呈正相關(guān)，依所測(cè)吸光,度值推算待測(cè)抗原的量,二、散射免疫比濁法,nephelometry,1967,年,Ritchie,等,利用激光照射在液相中,CIC,微粒上時(shí)，部分光線,發(fā)生散射的原理，通過(guò)測(cè)量散射光的強(qiáng)度來(lái)得知待,測(cè)抗原的量，稱為散射比濁法,nephelometry,1977,年,Sternberg,建立了速率散射比濁法,rate nephelometry,使

13、微量抗原的定量測(cè)定得以快速靈敏地進(jìn)行,一,基本原理,利用激光照射在液相中的,CIC,微粒上時(shí)部分光線發(fā),生散射的原理，通過(guò)測(cè)量散射光的強(qiáng)度來(lái)得知待測(cè),抗原的量,沿水平軸照射的一定波長(zhǎng)的光通過(guò)溶液時(shí)，被免,疫復(fù)合物粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生,散射光,散射光強(qiáng)度與粒子的濃度和體積成正比,散射比濁法的靈敏度和特異性比透射比濁,法高,Nephelometry,二,技術(shù)類型,散射比濁法分為,終點(diǎn)散射比濁法,end-point nephelomtry,速率散射比濁法,rate nephelometry,1,終點(diǎn)散射比濁法,當(dāng)抗原,抗體相遇后，反應(yīng)達(dá)到平衡通常需,10,30min,免疫濁度測(cè)定應(yīng)在復(fù)合物聚

14、合產(chǎn)生絮狀沉淀之前進(jìn)行,否則光散射值降低，影響測(cè)定結(jié)果,因此，終點(diǎn)散射比濁是在免疫反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間,時(shí)測(cè)量其濁度,2,速率散射比濁法,速率是指單位時(shí)間內(nèi)抗原與抗體反應(yīng)的速度,抗原與抗體結(jié)合形成,IC,的速度，在每個(gè)單位時(shí)間內(nèi),是不相同的，在抗體過(guò)量的情況下，隨著反應(yīng)時(shí)間,的延長(zhǎng)，免疫復(fù)合物的總量逐漸增加，通常在,25s,時(shí),出現(xiàn)一個(gè)反應(yīng)最快的速率峰，峰值與抗原量呈正相,關(guān),速率散射比濁法,是測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)免疫復(fù)合物形成的最快時(shí)間,段的散射信號(hào)值,三、速率抑制免疫比濁法,rate inhibition immunoturbidimetry,是一種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)，主要用于測(cè)定半抗原和,藥物等小分

15、子物質(zhì),試驗(yàn)時(shí)先將,一定量,的已知半抗原,載體（大分子,與,限量,的特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，生成的免疫復(fù)合,物可形成一定的速率散射峰值,待測(cè)抗原與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，速率散射峰值降低,降低程度與標(biāo)本中的待測(cè)半抗原成正比,四、免疫膠乳濁度測(cè)定法,immunolatex turbidimetry,免疫膠乳濁度測(cè)定法,與透射免疫比濁法基本相似,為一種帶,載體,的免疫比濁法，提高了免疫,濁度測(cè)定的靈敏度,一,基本原理,將抗體吸附到膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí),膠乳顆粒發(fā)生凝集,單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)，光線可透過(guò),當(dāng)兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)，則使透過(guò)光減少,吸光度,A,值）與膠乳凝聚程度成正比，并與待測(cè),抗原

16、量直接相關(guān),五、免疫濁度分析的影響因素,抗體必須適量過(guò)剩，以保證,IC,復(fù)合物的生成量與濁,度的改變一致,一）抗體試劑的質(zhì)量,1,抗體質(zhì)量：特異性強(qiáng),效價(jià)高,親和力強(qiáng),2,抗體類型,R,型,親和力強(qiáng),不易解離,抗體過(guò)剩時(shí)易形,成大而穩(wěn)定的,IC,H,型：親和力弱,易解離,二）抗原抗體比例,抗體必須適量過(guò)剩，以保證,IC,復(fù)合物的生成,量與濁度的改變一致,抗體過(guò)量,IC,的形成隨著抗原量的增加而遞,增,抗原過(guò)量，形成的,IC,分子小，易發(fā)生解離,三）反應(yīng)條件,提供,合適,pH,合適離子強(qiáng)度,四）增濁劑的作用,加入,PEG,Tween-20,等，可以促進(jìn),IC,的形,成，增加反應(yīng)濁度,增濁劑作用原理,是消除蛋白質(zhì)分子周?chē)碾娮釉坪退瘜?，?進(jìn)抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)合,濃度,3-4,過(guò)高易引起非特異蛋白沉淀,偽濁度,五）標(biāo)本因素,高血脂易引起非特異反應(yīng),內(nèi)源性免疫復(fù)合物影響測(cè)定結(jié)果,高混濁標(biāo)本不能用于檢測(cè)