胰蛋白酶的活力的測(cè)定.ppt

1、胰蛋白酶的活力的測(cè)定,一、酶的化學(xué)本質(zhì) 概念 是一類生物催化劑。 化學(xué)本質(zhì) 絕大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，某些RNA或DNA也具有催化活性,二、酶的化學(xué)組成,蛋白質(zhì)的酶,單純蛋白質(zhì)的酶,全酶,酶蛋白apoenzyme,輔助因子cofactor,輔助因子 輔基/輔酶小分子有機(jī)化合物、金屬離子，直接參加反應(yīng)。直接對(duì)電子、原子或某些化學(xué)集團(tuán)起傳遞作用。 酶蛋白 決定反應(yīng)特異性（專一性）。 一種輔助因子可與多種酶蛋白結(jié)合；一種酶蛋白只能與一種輔助因子結(jié)合,三、酶的活性中心 必需基團(tuán) 酶分子中與催化作用直接相關(guān)、不可缺少的化學(xué)基團(tuán)。 活性中心 酶分子中必需基團(tuán)相對(duì)集中，構(gòu)成一定空間結(jié)構(gòu)區(qū)域，與催化作用直接相關(guān),活

2、性中心,結(jié)合部位 （底物,催化部位（底物的鍵在此處被打斷或形成新的鍵,用于判斷和確定酶活型中心的主要方法： 1、專一性研究 通過(guò)研究酶的專一性底物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，來(lái)判斷 和確定活性中心的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 2、酶?jìng)?cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法 酶分子中可以被化學(xué)修飾的基團(tuán) 很多，如巰基、羥基、咪唑基、氨基及羧基 等,四、酶的命名與分類 習(xí)慣命名法 按催化反應(yīng)類型分類 脫氫酶、脫羧酶、連接酶、聚合酶等。 按組織來(lái)源及性質(zhì)分類 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/堿性磷酸酶等。 國(guó)際系統(tǒng)分類,酶原與酶原激活 無(wú)活性的酶前身物稱酶原。由無(wú)活性酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚悦傅倪^(guò)程稱酶原激活。 同工酶 分子結(jié)構(gòu)不同、理化性質(zhì)也不同，但催化同一化學(xué)

3、反應(yīng)的一組酶，如乳酸脫氫酶（LDH）。 別位酶 多亞基組成，其中有催化亞基、有調(diào)節(jié)亞基，小分子化合物結(jié)合調(diào)節(jié)亞基后分子構(gòu)象改變，引起催化活性改變,五、酶的活力測(cè)定,酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。 酶活力單位（國(guó)際單位） 標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下，每分鐘使一微克分子作用物發(fā)生轉(zhuǎn)變的酶量。人們普遍 采用是習(xí)慣用法，如a-淀粉酶，可用每小時(shí)催化1克可溶性淀粉所需要的酶量來(lái)表示,胰蛋白酶活力單位的定義規(guī)定為：以BAEE為底物反應(yīng)液pH8.0，25，反應(yīng)體積3.0ml，光徑1厘米的條件下，測(cè)定A253，每分鐘使A253增加0.001，反應(yīng)液中所加入的酶量為一BAEE單位,初速

4、度 研究酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)以酶促反應(yīng)的初速度為準(zhǔn),酶活力與酶反應(yīng)速度,時(shí)間,以N-苯甲酰-L精氨酸乙酯為底物，用紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定的原理是：N苯甲酰L精氨酸乙酯英文縮寫(xiě)為BAEE）在波長(zhǎng)253nm下的紫外吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于苯甲酰L精氨酸（英文縮寫(xiě)為BA）。在胰蛋白酶的催化下，隨著酯鍵的水解，苯甲酰L精氨酸逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外吸收宜隨之相應(yīng)增加,操作方法 取2個(gè)光程為1厘米的帶蓋石英比色杯，分別加入25予熱過(guò)的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作為空白，校正儀器的253nm處光吸收零點(diǎn)。再在另一比色杯中加入0.2ml待測(cè)酶液，立即混勻并記時(shí)，每半分鐘讀數(shù)一次，共讀34分鐘。 繪制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，從曲線上求