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文檔簡介

1、動物肝臟中DNA的提取及檢測、前言脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(DNA,為英文Deoxyribonucleic?acid 的縮寫),又稱 去氧核糖核酸,是脫氧核糖核酸染色體的主要化學成分,同時也是組成基因 的材料。有時也被稱為“遺傳微粒”,原因是在繁殖過程中,父代會把它們 自己DNA的一部分復制傳遞到子代中,從而完成性狀的傳播。DNA是高分子聚合物,DNA溶液為高分子溶液,具有很高的粘度,可被甲基綠染成綠色。DNA對紫外線(260nm )有吸收作用,利用這一特性, 可以對DNA進行含量測定。當核酸變性時,吸光度升高,稱為增色效應;當變性核酸重新復性時,吸光度又會恢復到原來的水平。較高溫度、有機溶

2、劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起 DNA分子變性,即DNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂,雙螺旋結構解開一也稱為 DNA的解螺旋。在細胞內,DNA能與蛋白質結合形成染色體,整組染色體則統(tǒng)稱為染色 體組。對于人類而言,正常的體細中含有 46條染色體。染色體在細胞分裂之前會先在分裂間期完成復制,細胞分裂間期又可劃分為:G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。對于真核生物,如動物、 植物及真菌而言,染色體主要存在于細胞核內;而對于原核生物,如細菌而 言,則主要存在于細胞質中的擬核內。染色體上的染色質蛋白,如組織蛋白, 能夠將DNA進行組織并壓縮,以幫助 DNA與其他蛋白質進行交互

3、作用,進而調節(jié)基因的轉錄。脫氧核糖核酸的結構DNA的結構:DNA的結構一般可劃分為一級結構、二級結構、三級結構和四級結構四個水平。DNA是一種長鏈聚合物,組成單位為四種脫氧核苷酸,即腺嘌呤脫氧核苷酸(dAMP脫氧腺苷)、胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTMP脫氧胸苷)、胞嘧啶脫氧核苷酸(dCMP脫氧胞苷)、鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGMP脫氧鳥苷)。而脫氧核糖(五碳糖)與磷酸分子借由酯鍵相連,組成其長鏈骨架,排列在外側,四種堿基排列在內側。每個糖分子都與四種堿基里的其中一種相連,這些堿基沿著DNA長鏈所排列而成的序列,可組成遺傳密碼,指導蛋白質的合成。讀取密碼的過程稱為轉錄,是以DNA雙鏈中的一條單鏈為模板轉

4、錄出一段稱為mRNA (信使RNA)的核酸分子。DNA是由許多脫氧核苷酸按一定堿基順序彼此用 3 , 5 -磷酸二酯鍵相連構成的長鏈。大多數(shù) DNA含有兩條這樣的長鏈,也有的 DNA為單鏈,如大腸桿菌噬菌體 X174、G4、M13等。DNA有環(huán)形DNA和鏈狀DNA之分。在某些類型的DNA中,5-甲基胞嘧啶可在一定限度內取代胞嘧啶,其中小麥胚DNA的5-甲基胞嘧啶特別豐富。在某些噬菌體中,5-羥甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年代后期,查加夫(E.Chargaff )發(fā)現(xiàn)不同物種DNA的堿基組成不同,但其中的腺嘌呤數(shù)等于其胸腺嘧啶數(shù)(A=T ),鳥嘌呤數(shù)等于胞嘧啶數(shù)(G=C ),因而嘌呤數(shù)之和等于嘧

5、啶數(shù)之和,一般用幾個層次描繪DNA的結構。濃鹽法從動物組織中提取 DNA核酸和蛋白質在生物體中常以核蛋白(DNP/RNP )的形式存在,其中DNP 能溶于水及高濃度鹽溶液,但在 0.14 M 的鹽溶液中溶解度很低,而RNP 則可溶于低鹽溶液, 因此可利用不同濃度的 NaCl 溶液將其從樣品中分 別抽提出來。將抽提得到的 DNP 用 SDS 處理可將其分離 DNA 和蛋白質, 用氯仿 -異戊醇將蛋白質沉淀除去可得 DNA 上清,加入冷乙醇即可將其呈纖 維狀析出。肝臟細胞肝臟是由肝細胞組成,肝細胞極小,肉眼看不到,必須通過顯微鏡才能 看到。人肝約有 25 億個肝細胞, 5000 個肝細胞組成一個肝

6、小葉, 因此人肝 的肝小葉總數(shù)約有 50 萬個。肝細胞為多角形,直徑約為 20-30/ 加(微米 ),有 6-8 個面,不同的生理條件下大小有差異,如饑餓時肝細胞體積變大。每 個肝細胞表面可分為竇狀隙面、肝細胞面和膽小管面三種。肝細胞里面含有 許許多多復雜的細微結構 :如肝細胞核、 肝細胞質、線粒體、內質網(wǎng)、溶酶體、 高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成。、實驗目的1. 掌握濃鹽法從動物組織中提取 DNA 的原理與技術三、實驗原理核酸和蛋白質在生物體中常以核蛋白( DNP/RNP )的形式存在,其中DNP 能溶于水及高濃度鹽溶液,但在 0.14 M 的鹽溶液中溶解度很低,而RNP 則可溶于低鹽溶液

7、, 因此可利用不同濃度的 NaCl 溶液將其從樣品中分 別抽提出來。將抽提得到的 DNP 用 SDS 處理可將其分離 DNA 和蛋白質,用氯仿 -異戊醇將蛋白質沉淀除去可得 DNA 上清,加入冷乙醇即可將其呈纖維狀析出。四、實驗器材和材料試劑實驗器材: 勻漿器 量筒 離心機 離心管 試管 吸管 恒溫水浴鍋實驗材料: 豬肝實驗試劑: O.1mol/L NaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉溶液(pH6.8) 95%乙醇(A. R.)NaCI 固體(A.R.) 5%SDS溶液(5g SDS 定容至100ml ) V(氯仿):V (異戊醇)20 : 1的混合液五、實驗操作1. 稱量稱取一定質量的豬肝,

8、加入 2倍肝重的O.1mol/L NaCI-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液并用勻漿器磨碎(已完成)。2.提取DNA量取肝糜4 ml于10毫升離心管,在4000r/min 下離心10min ,沉淀中再加入8 ml緩沖液于4000r/min 離心5 min ;棄上清,取沉淀;將沉淀用10ml檸檬酸鈉緩沖液完全洗入干凈的小燒杯、加入5 ml氯仿-異戊醇混合液、1 ml SDS,振蕩30min (保鮮膜封口);緩慢加入固體NaCI (約0.9g ),使其最終濃度為1mol/L ;將溶液分裝到2個10毫升離心管中,在4000r/min 離心5 min,取上清水相;在上述水相溶液中分別加等體積冷95%乙

9、醇,邊加邊用玻棒慢慢朝一個方向攪動,將纏繞在玻棒上的凝膠狀物用濾紙吸去多余的乙醇,即得DNA粗品;用8ml蒸餾水溶解DNA粗品于10ml離心管中。3.標準曲線的繪制按下表加入各種 試劑,混勻,于60 C恒溫水浴鍋45min,冷卻后,在595nm 波長下于分光光度計比色測定,以吸光度對DNA濃度作圖,制作012345標準DNA溶液0.00.40.81.21.62.0/ml蒸餾水/ml2.01.61.20.80.40標準曲線。二苯胺試劑/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm4.樣品的測定將DNA粗品定容至25ml容量瓶,再取DNA樣液1.0ml ,加入蒸餾水1.0ml,混勻。然后準

10、確加入二苯胺試劑 4.0ml,混勻,于60 C恒溫水浴鍋45min,冷卻后,595nm波長下于分光光度計比色測定,根據(jù)所測的吸光度對照標準曲線求得DNA的質量(ug )。5.計算100g豬肝中DNA含量w=m1/m2 X100%w: DNA的質量分數(shù)(%)m1 :樣液中測得的DNA的質量(ug)m2 :樣液中所含樣品的質量(ug)六、實驗數(shù)據(jù)處理1.標準曲線012345標準DNA溶液0.00.40.81.21.62.0/ml蒸餾水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺試劑/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm00.0390.090.1460.1970.249DNA含量/u

11、g0801602403204002.實驗結果處理豬肝質量為2.04gDNA提取液體積為12.53ml序號123A595nm0.1020.1020.101平均A595nm0.102樣液中DNA含量/ug171.4樣液中樣品質量/g0.1628根據(jù)公式w=m1/m2 X100%得:w=0.1053 %則100g豬肝中DNA含量為:wxi00=0.1053g七、思考題1.實驗中的乙醇、SDS、氯仿-異戊醇、NaCI、檸檬酸鈉分別有什么作用?答:檸檬酸的鈉鹽在實驗中既充當 DNA酶的抑制劑,也是pH緩沖溶液; SDS是表面活性劑,可以讓蛋白質與 DNA分開; 氯仿是有機溶劑,可以使蛋白質聚集沉淀,便于

12、分離出去; 異戊醇是消泡劑,可以減少泡沫的發(fā)生; 氯仿-異戊醇的作用是使蛋白質變性、膜溶解; NaCI固體溶解使得試液成為高濃度的鹽溶液,在這樣的環(huán)境中DNA核蛋白能溶解,RNA核蛋白則溶解度很低,可以利用這一性質分離兩種核酸。八、實驗注意事項1.DNA 主要集中在細胞核中,因此,通常選用細胞核含量比例大的生 活組織作為提取制備 DNA 的材料,小牛胸腺組織中細胞核比例較大,因而DNA 含量豐富,同時其脫氧核苷酸酶活性較低,制備過程中 DNA 被降解 的可能性相對較低,所以是制備 DNA 的良好材料,但其來源較困難,脾臟 或肝臟易獲得,也是實驗室制備 DNA 常用的材料,本實驗用新鮮肝臟作為

13、實驗材料。2. 為了防止大分子核酸在提取過程中被降解,須采取以下措施:整個過程必須在低溫下進行,可加入某些物質抑制核酸酶的活性,如檸檬酸鈉、EDTA、SDS等,EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制劑。3. 從核蛋白中脫去蛋白質的方法很多,經(jīng)常采用的有:氯仿- 異丙醇法、 苯酚法、去垢劑法等, 他們均能使蛋白質變性和核蛋白解聚, 并釋放出核酸。4.使用離心機時,對稱放置的離心管必須用天平調平衡。5.避免劇烈振蕩,如研磨過程、攪拌過程等。九、實驗結果誤差分析及討論經(jīng)過對本次實驗結果進行分析, 得出 100g 豬肝中 DNA 含量大約為 0.1053g的結論,在上網(wǎng)查閱相關資料后發(fā)現(xiàn):豬肝中 DNA

14、 含量與本次試驗實際操 作測量得出的結果大致相互吻合。由此可知,本次試驗結果是相對比較成功 的,較為粗略地測量出豬肝中 DNA 的含量,并且較為熟練地掌握了濃鹽法 從動物組織中提取 DNA 的原理與技術,基本達到了本次實驗的目的。但是本次實驗結果只是粗略測量,并未達到精確測量豬肝中 DNA 的含量,且實驗數(shù)據(jù)較理論值偏低,這是由于某些誤差導致,在實驗過程中些許 因素可能會導致實驗結果數(shù)據(jù)有偏差,經(jīng)分析得出以下幾點:在稱取豬肝后加入檸檬酸鈉緩沖液進行研磨的過程中, 由于豬肝組織 表面較滑不易磨碎,且研磨至最后依舊有小部分豬肝組織塊殘留,因此可能 導致豬肝中 DNA 提取不充分,致使實驗數(shù)據(jù)較理論值偏低; 研磨過程中,可能由于操作不當,導致部分液體濺出,因此可能使得 提取液中部分 DNA 損失,導致實驗數(shù)據(jù)偏低; 在粗提取 DNA 操作中,頻繁地將 DNA 提取液轉移至各個儀器內, 可能有極小部分 DNA 提取液未倒凈,殘留在儀器壁上損耗掉,導致實驗誤 差; 在使用移液槍的過程中,可能因為操作不當或移液槍經(jīng)常錯誤使用, 出現(xiàn)儀器誤差,導致吸取的 DNA 樣液不精確,出現(xiàn)實驗誤差; 在水相中加入乙醇析出 DNA 時,不是所有

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