課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用,2、細(xì)菌能利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?3、常見(jiàn)的分解尿素的微生物,芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線(xiàn)菌也能分解尿素,4、課題目的,一.研究思路,篩選菌株,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,設(shè)置對(duì)照,1、了解從土壤中分離微生物的基本原理。 2、了解土壤微生物測(cè)數(shù)的基本原理。 3、學(xué)習(xí)并掌握微生物平板菌落計(jì)數(shù)的技術(shù)方法,要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、

2、生長(zhǎng)條件等； 方法： 抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng) 促進(jìn)目的菌株的生長(zhǎng) 結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離,2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理,人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng),3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中,碳源：葡萄糖 氮源：尿素,培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物,5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理,從肥沃、酸堿度接近中

3、性的濕潤(rùn)土壤中取樣。先鏟去表層土3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中,微生物的天然培養(yǎng)基,一土壤取樣,數(shù)量最大、種類(lèi)最多,大約70%90%是細(xì)菌,取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌,二制備培養(yǎng)基,由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒(méi)有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103107。 準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。還需要8個(gè)滅菌試管和1個(gè)滅菌移液管 。 將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否起

4、到了選擇作用,應(yīng)在火焰旁稱(chēng)取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板,三）樣品的稀釋,取樣涂布,實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類(lèi)型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn),1、顯微鏡直接計(jì)數(shù),利用血球計(jì)數(shù)板(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板），在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,不能區(qū)分死

5、菌與活菌； 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察,缺點(diǎn),血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu),它是特制的厚載玻片，中央?yún)^(qū)域有四條凹槽而形成三個(gè)平臺(tái)，中間平臺(tái)較寬，它又被一短橫槽分隔為兩部分，每一部分均有一個(gè)方格網(wǎng)，每一方格網(wǎng)可分為九個(gè)大方格，中央大方格就是計(jì)數(shù)室。大方格分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又可分為16個(gè)小方格。每個(gè)大方格共含有400個(gè)小方格。計(jì)數(shù)室大方格邊長(zhǎng)為1mm，底面積為1mm2，高0.1mm,所以每個(gè)計(jì)數(shù)室固定容積為0.1mm3,計(jì)數(shù)方法,在計(jì)數(shù)時(shí)，用含16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，要按對(duì)角線(xiàn)方位計(jì)數(shù)左上、左下、右上、右下等四個(gè)中方格（100個(gè)小方格）所含有的菌數(shù)

6、；由此可計(jì)算得出每個(gè)小方格所含有的菌數(shù)的平均值， 計(jì)數(shù)室每個(gè)小方格容積為： 0.110-34001410-6(ml) 計(jì)算公式： 每ml菌液含菌數(shù) = N K d (N：每個(gè)小方格含菌數(shù)平均值； d：菌液稀釋倍數(shù)； K=4106,2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù),注意事項(xiàng) 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的

7、平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。 為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平板中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低,菌落計(jì)數(shù)規(guī)則： 選擇平均菌落數(shù)在30300間的平板 1、只有一個(gè)稀釋度符合，以該稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告； 2、有兩個(gè)稀釋度符合，取決于二者比值（高稀釋度的菌落數(shù)除以低稀釋度的菌落數(shù)的值） 1）若0.5比值2，以?xún)上♂尪鹊木鋽?shù)乘稀釋倍數(shù)所得的值的均值報(bào)告。 2）若2比值或比值 0.5，則取其中較少的菌落總數(shù)進(jìn)行報(bào)告。 3、若所有稀釋度的菌落平均數(shù)均大于300，則按稀釋倍數(shù)最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告； 4、若所有稀釋度的菌落平均數(shù)均小于30，則按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告； 所有菌落數(shù)均不在30300間，以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù),1.在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌