藥學分子生物學：第三章 基因表達的調控

1、第三章第三節(jié) 基因表達的調控第三章第三節(jié) 基因表達的調控基因：（生物學定義）是攜帶生物體遺傳信息的結構單位。（分子生物學定義）合成有功能的蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。u 按照這個定義，一個基因應包括： 編碼蛋白質多肽鏈或RNA的核酸序列； 保證轉錄所必需的調控序列、5端非翻譯序列、內含子、3端非翻譯序列等所有的核酸序列?；蚍肿游挥谌旧w上，它可通過復制把遺傳信息傳遞給下一代，從而使后代表現(xiàn)出與親代相似的性狀。基因與DNA分子一方面在生物界中，并非所有的基因都是由DNA構成的，某些病毒、噬菌體等生物的遺傳物質是RNA而不是DNA；另一方面DNA分子并不一定就是

2、基因。有些DNA序列，如衛(wèi)星DNA、rRNA基因間的空檔區(qū)等，不論是單拷貝或多拷貝的都是非轉錄的，它們既不編碼蛋白質又不編碼RNA，是一些不能作為基因的DNA分子。 基因表達調控基本概念與原理一、基因表達的概念基因表達: 是指通過轉錄和翻譯而產生其蛋白質產物，或轉錄后直接產生其RNA產物（如tRNA、rRNA等）的過程?；虮磉_調控：圍繞基因表達過程中發(fā)生的各種各樣的調節(jié)方式都通稱為基因表達調控?；虮磉_調控的意義u 人類基因組DNA中約含5萬個基因，但在某一特定時期，只有少數(shù)的基因處于轉錄激活狀態(tài)，其余大多數(shù)基因則處于靜息狀態(tài)。一般來說，在大部分情況下，處于轉錄激活狀態(tài)的基因僅占5%。u 通

3、過基因表達以合成特異性蛋白質，從而賦予細胞以特定的生理功能或形態(tài)，以適應內外環(huán)境的改變。 結構基因：是編碼蛋白質或RNA的任何基因。調節(jié)基因：是參與其他基因表達調控的RNA或蛋白質的編碼基因。調節(jié)物與DNA特定位點的相互作用能以正調控的方式（啟動或增強基因表達活性）調節(jié)靶基因，也能以負調控的方式（關閉或降低基因表達活性）調節(jié)靶基因?；虻慕Y構包括: 調控序列和結構基因兩部分二、基因表達的時間性及空間性（一）時間特異性：基因表達的時間特異性(temporal specificity)：是指特定基因的表達嚴格按照特定的時間順序發(fā)生，以適應細胞或個體特定分化、發(fā)育階段的需要。故又稱為階段特異性。 u

4、 在多細胞生物的生長發(fā)育過程中，相應的基因按一定的時間順序開啟和關閉，決定細胞的特定的方向分化和發(fā)育。（二）空間特異性：基因表達的空間特異性（spatial specificity）是指多細胞生物個體在某一特定生長發(fā)育階段，同一基因的表達在不同的細胞或組織器官不同，從而導致特異性的蛋白質分布于不同的細胞或組織器官。故又稱為細胞特異性或組織特異性。 三、基因表達的方式（一）組成性表達：組成性基因表達（constitutive gene expression）是指在個體發(fā)育的任一階段都能在大多數(shù)細胞中持續(xù)進行的基因表達。其基因表達產物通常是對生命過程必需的或必不可少的，且較少受環(huán)境因素的影響。這類

5、基因通常被稱為管家基因（housekeeping gene）。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等 （二）誘導和阻遏表達：誘導表達（induction）是指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被激活，從而使基因的表達產物增加。這類基因稱為可誘導基因。阻遏表達（repression）是指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被抑制，從而使基因的表達產物減少。這類基因稱為可阻遏基因。 五、基因表達調控的基本原理（一）基因表達的多級調控：基因表達調控可見于從基因激活到蛋白質生物合成的各個階段，因此基因表達的調控可分為轉錄水平（基因激活及轉錄起始），轉錄后水平（加工及轉運），翻譯水平及翻譯后水平，但以轉錄水平的

6、基因表達調控最重要。 四個基本的調控點：1. 基因結構的活化 DNA暴露堿基后RNA聚合酶才能有效結合。活化狀態(tài)的基因表現(xiàn)為： 對核酸酶敏感； 結合有非組蛋白及修飾的組蛋白； 低甲基化。2. 轉錄起始 最有效的調節(jié)環(huán)節(jié)，通過DNA元件與調控蛋白相互作用來調控基因表達。3. 轉錄后加工及轉運 RNA編輯、剪接、轉運。4. 翻譯及翻譯后加工 翻譯水平可通過特異的蛋白因子阻斷mRNA翻譯翻譯后對蛋白的加工、修飾也是基本調控環(huán)節(jié)。（二）基因轉錄激活調節(jié)基本要素：1順式作用元件（cis-acting element）又稱分子內作用元件，指存在于同一DNA分子上的一些與基因轉錄調控有關的特殊順序。與相關基

7、因處于同一DNA分子上,能起到調控作用的DNA序列.特征:1. 不轉錄任何產物2. 可位于結構基因的不同部位.3. 是DNA序列而不是蛋白和RNA.4. 包括啟動子、終止子、增強子、衰減子等原核與真核生物的順式作用元件u 在原核生物中，大多數(shù)基因表達通過操縱子模型進行調控，其順式作用元件主要由啟動基因、操縱基因和調節(jié)基因組成。u 在真核生物中，與基因表達調控有關的順式作用元件主要有啟動子（promoter）、增強子（enhancer）和沉默子（silencer）。 2反式作用因子（trans-acting factor）又稱為分子間作用因子，指一些與基因表達調控有關的蛋白質因子或RNA。反式作

8、用因子與順式作用元件之間的共同作用，才能夠達到對特定基因進行調控的目的。原核生物中的反式作用因子主要分為特異因子、激活蛋白和阻遏蛋白；而真核生物中的反式作用因子通常稱為轉錄因子。 具有對基因表達產生調控作用的基因產物。特征：1. 為基因的產物，蛋白質、tRNA、rRNA。2. 可在同一DNA分子上，也可在不同的DNA分子上。3. 具有多效性，對多種基因表達具有調控作用。3順式作用元件與反式作用因子之間的相互作用：大多數(shù)調節(jié)蛋白在與DNA結合之前，需先通過蛋白質-蛋白質相互作用，形成二聚體或多聚體，然后再通過識別特定的順式作用元件，而與DNA分子結合。這種結合通常是非共價鍵結合。 小結u 基因u

9、 合成有功能的蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。u 重疊基因、等位基因、復等位基因、斷裂基因、跳躍基因、假基因u 結構基因、調控基因u 基因表達的時空性u 基因表達的四個基本調控點u 順式作用元件、反式作用因子一、原核生物基因表達調控（一）操縱子的結構與功能在原核生物中，若干結構基因可串聯(lián)在一起，其表達受到同一調控系統(tǒng)的調控，這種基因的組織形式稱為操縱子（operon） 。 典型的操縱子可分為：控制區(qū)和信息區(qū)?？刂茀^(qū)由各種調控基因所組成，而信息區(qū)則由若干結構基因串聯(lián)在一起構成。 操縱子的構成以原核生物乳糖操縱子(Lac operon)為例，其控制區(qū)包括調節(jié)基因（阻遏

10、基因），啟動基因（其CRP結合位點位于RNA聚合酶結合位點上游）和操縱基因；其信息區(qū)由-半乳糖苷酶基因（lacZ），通透酶基因（lacY）和乙?；富颍╨acA）串聯(lián)在一起構成。 (1) 結構基因群(2) 啟動子(3) 操縱基因(4) 調控基因(5) 終止子操縱子(operon)：是原核生物細胞DNA上的一段區(qū)域，由若干功能相關的結構基因和控制這些基因表達的元件組成的一個完整的連續(xù)的功能單元。1. 結構基因群操縱子中被調控的編碼蛋白質的基因可稱為結構基因(structural gene, SG)。一個操縱單元中含有2個以上的結構基因，多的可達十幾個；每個結構基因是一個連續(xù)的開放讀框，5端有翻

11、譯起始碼，3端有翻譯終止碼；各結構基因頭尾銜接、串連排列，組成結構基因群；至少在第一個結構基因5側具有核糖體結合位點(ribosome binding site, RBS，SD)2.啟動子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶識別、結合并啟動基因轉錄的一段DNA序列。u 操縱單元至少有一個啟動子，一般在第一個結構基因5側上游，控制整個結構基因群的轉錄u 轉錄起始第一個堿基(通常標記位置為1)最常見的是A；u Pribnow盒(Pribnow box)：3.操縱基因（O）：是指能被調控蛋白特異性結合的一段DNA序列常與啟動子鄰近或與啟動子序列重疊，當調控蛋白結合在操縱基因序列上，會影響其

12、下游基因轉錄的強弱。凡能與調控蛋白特異性結合、從而影響基因轉錄強弱的序列，不論其對基因轉錄的作用是減弱、阻止或增強、開放，都可稱為操縱基因。4.調控基因(regulatory gene):具有調控其他基因性狀功能的基因，稱為調控基因（R or I）。調控基因編碼能與操縱基因結合的調控蛋白的基因。與操縱基因結合后能減弱或阻止其調控基因轉錄的調控蛋白稱為阻遏蛋白(repressive protein)，其介導的調控方式稱為負性調控(negative regulation)；與操縱子結合后能增強或起動調控基因轉錄的調控蛋白稱為激活蛋白(activating protein)，所介導的調控方式稱為正性

13、調控(positive regulation)。5.終止子(terminator T)：是給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列。在一個操縱元中至少在結構基因群最后一個基因的后面有一個終止子。u 依賴因子的終止子，即其終止轉錄的作用需要因子的協(xié)同，或至少是受因子的影響。u 不依賴因子(蛋白性終止因子)的終止子。終止子的特征共同特征：轉錄終止前有一段回文序列，回文序列的兩個重復部分(每個722 bp)由幾個堿基對的不重復區(qū)段隔開。不同之處在于回文序列的堿基組成：u 不依賴于因子的終止子：富含G-C堿基對，其下游又常有68個A-T堿基對(模板鏈上為A)u 依賴于因子的終止子：G-C含量較少，其下

14、游序列無固定特征，其A-T堿基含量低。不依賴于因子的終止子-其結構有三個特點： 有回文結構存在。由它轉錄出mRNA可形成莖環(huán)結構，可阻止RNA pol的前進； 莖的區(qū)域富內含G-C，使莖環(huán)不易解開； 強終止子3端上有6個U，由于它和模板形成的連續(xù)U-A配對較易打開，從而便于釋放出RNA。依賴于因子的終止子-其結構特征： u 回文序列。u 識別一個位于終止位點前的不連續(xù)區(qū)域，長5090nt。分析這段序列發(fā)現(xiàn)其共同特點是C豐富，G缺乏u 作為一般的規(guī)律，-依賴性終止子的效率隨著富C/貧G區(qū)域長度的增加而增加。操縱子的5種元件u 以上5種元件是每一個操縱單元必定含有的。u 其中啟動子、操縱基因和終止

15、子屬于順式作用元件u 調控基因屬于反式作用元件（二）乳糖操縱子的調控機制1. 乳糖操縱子：乳糖操縱單元含有z、y和a三個結構基因z基因長3510bp，編碼含1170個氨基酸、分子量為135000的多肽，以四聚體形式組成有活性的半乳糖苷酶，催化乳糖（lactose， Lac）轉變?yōu)閯e乳糖(allolactose)，再分解為半乳糖和葡萄糖；y基因長780bp，編碼由260個氨基酸組成、分子量30000的半乳糖透過酶，促使環(huán)境中的乳糖進入細菌；a基因長825bp，編碼含275氨基酸、分子量為32000的轉乙?；?，以二聚體活性形式催化半乳糖的乙?；?。乳糖代謝 -半乳糖苷酶(-galactosidas

16、e)酶是乳糖代謝的第一個酶，它將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖。 -半乳糖苷透膜酶是一種膜結合蛋白，能促進乳糖進入細胞 。2. 阻遏蛋白的負性調控調節(jié)基因位于操縱子外面，lac操縱子外的調節(jié)基因lacI能產生一種阻遏物。這種阻遏物是一種由360個氨基酸組成的蛋白質，有活性的阻遏蛋白是四聚體。當培養(yǎng)基中沒有乳糖時，阻遏蛋白便與結構基因緊密連接的操縱子相結合，阻斷了RNA聚合酶與操縱基因的結合，結構基因形成mRNA的轉錄過程不能開始，從而乳糖代謝所必需的3種酶不能合成 。當培養(yǎng)基中的碳源為乳糖時，乳糖進入細胞后，即作為誘導物與阻遏蛋白結合，使阻遏物的構型改變，失去跟操縱基因結合的能力，這時mRNA聚合酶

17、便與啟動基因結合，從而結構基因產生mRNA的轉錄過程和蛋白質的合成過程得以開始，所產生的3種酶即作用于乳糖上。乳糖被分解后，阻遏物又發(fā)生作用，酶的合成便又停止進行。 阻遏蛋白結合如何能阻止操縱子的轉錄？u 對操縱基因及其鄰近部分順序分析表明，操縱基因的位置在-5+21bp之間，而RNA聚合酶保護區(qū)域是-48+5bp之間，也就是說，RNA聚合酶和阻遏蛋白的結合位點是重疊的。這兩種蛋白質中的任何一種與DNA結合后，就會阻止另一種蛋白質的結合。u 在其它操縱子中也有類似的情況，阻遏蛋白與操縱基因結合即會阻止RNA聚合酶與啟動子結合，從而抑制操縱子基因的表達。異丙基硫代半乳糖苷u 異丙基硫代半乳糖苷(

18、isopropylthiogalactoside, IPTG) 為化學合成的乳糖類似物，是很強的誘導劑。不受半乳糖苷酶的催化分解，不被細胞代謝而十分穩(wěn)定，可與阻遏蛋白特異性結合，使其構象變化，誘導1ac操縱元的開放。u 實驗中用于誘導大腸桿細表達基因重組蛋白的常用試劑。XgalXgal(5溴4氯3吲哚半乳糖苷)也是一種人工化學合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解產生蘭色化合物，因此可以用作半乳糖苷酶活性的指示劑。Xgal被廣泛應用在分子生物學和基因工程的工作中。小結操縱子的結構與功能：結構基因群、啟動子、操縱基因、調控基因、終止子乳糖操縱子及其阻遏蛋白的負性調控。3. CAP的正性調控cAMP受

19、體蛋白(cAMP receptor protieinCRP)；又稱分解物基因激活蛋白(catobolite gene activation protein，CAP) 是一種二聚體蛋白質，每個亞基含209個氨基酸殘基，可起轉錄起始因子的作用，并在有cAMP時，能使操縱子有效地進行轉錄。 CAP結合位點的結構CAP結構變化與cAMP的結合有關。采用保護降解法的分析，可知在lac P區(qū)上游-72-52核苷酸對處有一個CAP結合位點，但只有在cAMP存在時，CAP才能結合于此位點。CAP結合位點中有一段對稱反向重復序列：這一序列的第3位和倒數(shù)第3位的GC對之一突變成AT對后，也影響cAMP-CAP與它

20、的結合，而成為啟動子下降突變。cAMP含量與葡萄糖的關系u 細菌中的cAMP含量與葡萄糖的分解代謝有關；u 葡萄糖可使腺苷酸環(huán)化酶活性降低； u 當細菌利用葡萄糖分解供給能量時，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，當環(huán)境中無葡萄糖可供利用時，cAMP含量就升高。（A）無葡萄糖時無葡萄糖時，cAMP含量增加，可同CAP結合形成具有活性的CAP- cAMP復合體，與啟動子區(qū)域的CAP位點結合，激活轉錄起始。（B） 有葡萄糖時有葡萄糖時，cAMP含量減少，不能形成CAP- cAMP復合體，不能啟動轉錄的起始。CAP的作用由于1acP是弱啟動子，單純因乳糖的存在所產生的去阻遏使1ac操縱單元

21、轉錄開放，還不能生產足夠的代謝酶使細菌很好利用乳糖，必須同時有CAP來加強轉錄活性，才能合成足夠的酶來利用乳糖。1ac操縱單元的強誘導既需要有乳糖的存在，又需要沒有葡萄糖可供利用。通過這種機制，細菌優(yōu)先利用環(huán)境中的葡萄糖，只有無葡萄糖而又有乳糖時，細菌才去充分利用乳糖。（三）色氨酸操縱子的調控機制 色氨酸操縱子(tryptophane operon，trp)負責色氨酸的生物合成，主要參與調控一系列用于色氨酸合成代謝的酶蛋白的轉錄合成。色氨酸操縱子（trp operon）屬于阻遏型操縱子，當培養(yǎng)基中有足夠的色氨酸時，這個操縱子自動關閉，缺乏色氨酸時操縱子被打開，trp基因表達，色氨酸與其代謝有關

22、的某種物質在阻遏過程（而不是誘導過程）中起作用。由于trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的調控。 色氨酸的合成色氨酸的合成分5步完成。每個環(huán)節(jié)需要一種酶，編碼這5種酶的基因緊密連鎖在一起，被轉錄在一條多順反子mRNA上，分別以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，編碼了鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉移酶、鄰氨基苯甲酸異構酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。 色氨酸操縱單元的結構1. 結構基因群合成色氨酸所需要酶類的基因E、D、C、B、A等頭尾相接串連排列組成2. 啟動子trpP和操縱基因trp3. 調控基因trpR的位置遠離P-結構

23、基因群，編碼分子量為47000的調控蛋白R4. 前導區(qū)trpL轉錄140bp的mRNA 2. 阻遏蛋白的負性調控色氨酸操縱子的調控機制與乳糖操縱子類似，但通常情況下，操縱子處于開放狀態(tài)，其輔阻遏蛋白不能與操縱基因結合而阻遏轉錄。因此這是屬于一種負性調控的、可阻遏的操縱元（repressible operon），即這操縱元通常是開放轉錄的，有效應物（色氨酸為阻遏劑）作用時則阻遏關閉轉錄。trp操縱子中產生阻遏物的基因是trpR，該基因距trp基因簇很遠 。細菌不少生物合成系統(tǒng)的操縱元都屬于這種類型，其調控可使細菌處在生存繁殖最經(jīng)濟最節(jié)省的狀態(tài)。 無色氨酸時由調控基因編碼的調控蛋白并沒有與操縱基因

24、結合的活性，因此不能阻遏色氨酸合成酶的轉錄。有色氨酸時而當色氨酸合成過多時，色氨酸作為輔阻遏物與輔阻遏蛋白結合而形成阻遏蛋白，后者與操縱基因結合而使基因轉錄關閉。 3. 衰減子及其作用阻遏-操縱機制對色氨酸來說是一個一級開關，主管轉錄是否啟動，相當于粗調開關。trp操縱子中對應于色氨酸生物合成的還有另一個系統(tǒng)進行細調控，指示已經(jīng)啟動的轉錄是否繼續(xù)下去。該細微調控是通過轉錄達到第一個結構基因之前的過早終止來實現(xiàn)的，由色氨酸的濃度來調節(jié)這種過早終止的頻率。轉錄衰減轉錄衰減(attenuation)機制：即在色氨酸操縱子第一個結構基因與啟動基因之間存在有一衰減區(qū)域，當細胞內色氨酸濃度很高時，通過與轉

25、錄相偶聯(lián)的翻譯過程，形成一個衰減子結構，使RNA聚合酶從DNA上脫落，導致轉錄終止。 人們發(fā)現(xiàn)當色氨酸達到一定濃度、但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時，產生色氨酸合成酶類的量已經(jīng)明顯降低，而且產生的酶量與色氨酸濃度呈負相關。這種調控現(xiàn)象與色氨酸操縱元特殊的結構有關。先導序列l(wèi) 在色氨酸操縱元Ptrp-與第一個結構基因trpE之間有162bp的一段先導序列（leading sequence，L），實驗證明當色氨酸存在一定濃度時，RNA聚合酶的轉錄會終止在這里.前導肽序列 分析前導肽序列，發(fā)現(xiàn)它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，編碼了一個14個氨基酸的多肽。該多肽有一個特征，其第1

26、0位和11位有相鄰的兩個色氨酸密碼子。正是這兩個相連的色氨酸密碼子（組氨酸、苯丙氨酸操縱子中都有這種現(xiàn)象）調控了蛋白質的合成。 先導序列發(fā)夾結構的形成u 片段1-和2配對可形成發(fā)夾結構，片段3和4同時能配對形成發(fā)夾結構；u 而片段2和3形成發(fā)夾結構時，其他片段配對二級結構就不能形成。衰減結構的形成u 片段3和4及其下游的序列與因子不依賴轉錄終止有關序列相似，形成終止結構。色氨酸濃度低時當色氨酸濃度低時，生成的tRNAtrp-色氨酸量就少，使核糖體沿mRNA翻譯移動的速度慢，趕不上RNA聚合酶沿DNA移動轉錄的速度，這時核糖體占據(jù)短開放讀框的機會較多，使1、2不能生成發(fā)夾結構，于是2、3就形成發(fā)

27、夾結構，阻止了3、4生成終止信號的結構，RNA聚合酶得以沿DNA前進，繼續(xù)去轉錄其后trpE等基因，trp操縱元就處于開放狀態(tài)。色氨酸濃度增高時當色氨酸濃度增高時，tRNAtrp-色氨酸濃度隨之升高，核糖體沿mRNA翻譯移動的速度加快，占據(jù)到2段的機會增加，2、3生成發(fā)夾結構的機會減少，3、4形成終止結構的機會增多，RNA聚合酶終止轉錄的幾率增加，于是轉錄減弱。當所有的氨基酸都不足時如果當其他氨基酸短缺或所有的氨基酸都不足時，核糖體翻譯移動的速度就更慢，甚至不能占據(jù)1的序列，結果有利于1、2和3、4發(fā)夾結構的形成，RNA聚合酶停止轉錄。小結 乳糖操縱子的正性調控：l cAMP-CAP復合物 色

28、氨酸操縱子的調控模式：l 阻遏蛋白的負性調控l 衰減子的作用機制二、真核基因表達調控真核生物與原核生物的基因調控差異（一）染色體結構對轉錄的影響1. 染色體重排的調控 真核生物基因組中的DNA序列可發(fā)生重排，這種重排是由特定基因組的遺傳信息決定的； 重排后的基因序列轉錄成mRNA，翻譯成蛋白質，在真核生物細胞生長發(fā)育中起關鍵作用； 因此，盡管基因組中的DNA序列重排并不是一種普通方式，但它是有些基因調控的重要機制。 基因重排的結果： 基因空間的位置改變 可伴有基因片段的擴增或丟失 染色體易位、外源基因的嵌入、整合如：費城染色體易位使9號染色體長臂（9q34）上的原癌基因abl和22號染色體(2

29、2q11)上的bcr(break point cluster region)基因重新組合成融合基因。后者具有增高的酪氨酸激酶活性特性，為慢性粒細胞性白血病的發(fā)病原因。2. 基因的丟失、擴增1） 基因丟失一些原生動物、昆蟲的個體發(fā)育過程中，許多體細胞常會丟失整條或部分染色體，只有生殖細胞中始終保留整套染色體。被丟失的染色體其上的遺傳信息可能對體細胞來說沒有什么意義，而對生殖細胞的發(fā)育也許是不可缺少的。例如：馬蛔蟲的發(fā)育馬蛔蟲受精卵細胞只有一對染色體（2n =2），但染色體上有多個著絲粒。在發(fā)育早期僅一個著位點發(fā)揮作用，保證正常有絲分裂的進行。發(fā)育后一階段，在縱裂的細胞中染色體分成很多小片段，其中

30、部分含著絲點，不含著絲點的片段在分裂中丟失。 這種丟失是不可逆的。2） 基因擴增rRNA基因的擴增非洲爪蟾的每條染色體上有約450拷貝編碼18S r RNA和28S r RNA的DNA，它們成簇存在，重復串聯(lián)在一起，形成核仁組織區(qū)。在卵母細胞中它們的拷貝數(shù)擴大了1000倍以上。產生的rRNA，組裝成核糖體，儲備在核仁中到減數(shù)分裂時再釋放出來。 卵母細胞為胚胎的發(fā)育提供營養(yǎng)物質，直到發(fā)育成蝌蚪階段。rRNA基因簇卵母細胞的核中有數(shù)以千計大小不等的核仁。每個核仁含有大小不同的環(huán)狀rDNA，它是染色體上18S和28S rDNA的串聯(lián)重復單位經(jīng)滾環(huán)復制從染色體上釋放出來的。3.染色質水平的調控u 真核

31、細胞中基因轉錄的模板是染色質而不是裸露的DNA，因此染色質呈疏松或緊密結構，即是否處于活化狀態(tài)是決定RNA聚合酶能否有效行使轉錄功能的關鍵。1） 活性染色質u 按功能狀態(tài)的不同可將染色質分為活性染色質和非活性染色質，所謂活性染色質是指具有轉錄活性的染色質；非活性染色質是指沒有轉錄活性的染色質。（1） 染色質活性狀態(tài)活性染色質由于核小體構型發(fā)生構象改變，往往具有疏松的染色質結構便于轉錄調控因子與順式調控元件結合和RNA聚合酶在轉錄模板上滑動。（2）活性染色質中的DNAu 轉錄活性高的區(qū)域呈現(xiàn)伸展蓬松的狀態(tài)；u DNA拓撲結構變化-天然雙鏈DNA均以負性超螺旋構象存在；（3） 活性染色質的結構特征

32、由于核小體的構象和組分發(fā)生明顯的變化：u 對DNase I呈現(xiàn)敏感性u 組蛋白H1含量減少u 核心組蛋白乙?；潭雀遳 H2A-H2B二聚體不穩(wěn)定DNase的敏感性和基因表達 u 當一個基因成為轉錄活性狀態(tài)時，含有這個基因的染色質區(qū)域對DNase（一種內切酶）降解的敏感性要比無轉錄活性區(qū)域高得多。這是由于此區(qū)域染色質的DNA蛋白質結構變得松散，DNase易于接觸到DNA之故。 DNase敏感區(qū)域u 只有在活躍表達的組織中的基因才顯示對DNase降解的敏感性；u 在某組織中，具有轉錄潛能的基因區(qū)域才能出現(xiàn)對DNase降解的敏感性；u 同一區(qū)域對DNase降解的敏感性不同，基因編碼區(qū)敏感性一般，而

33、調控區(qū)域高度敏感-超敏感區(qū)域。（二）DNA的修飾-DNA的甲基化；組蛋白的修飾1. DNA的甲基化和去甲基化u DNA上存在著細胞行使各種功能所需要的各種信息，在行使不同功能時又需在DNA上利用或消除有關的信息，這種利用和消除可能是由DNA可逆性甲基化提供的。 u 在不表達的基因中，啟動區(qū)的甲基化程度很高，而處于活化狀態(tài)的基因則甲基化程度較低 。u 甲基化可使基因失活，去甲基化又可使基因恢復活性。 DNA甲基化參與基因表達調控l DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，可能存在于所有高等生物中。l DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。l DNA甲基化的主要形式

34、 5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。 在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在CpG中，原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常發(fā)育而死亡，可見DNA的甲基化對基因表達調控是重要的DNA甲基化至少可導致n 甲基化阻遏RNA聚合酶對啟動子的識別n 妨礙RNA聚合酶對DNA模板的識別2. 組蛋白的修飾u 各種真核生物中的組蛋白極端保守，其氨基酸順序、結構和功能都十分相似；u 組蛋白仍可被修飾，如甲基化，乙酰基化和磷酸化；u 組蛋白被修飾，使其和DNA的結合由緊變松，這樣DNA鏈才能和RNA聚合酶或調節(jié)蛋白相互作

35、用。因此組蛋白的作用本質上是真核基因調節(jié)的負控制因子，即它們是基因轉錄的抑制物。核小體結構變化對基因表達的影響u 核小體是染色質的基本結構單位。目前已有許多實驗均證明，核小體在基因表達中起作重要的作用。u 一般來說，核小體覆蓋了整個染色質；u 但是核小體的分布并不是隨機的、均勻的。在染色質上核小體的定位與DNA分子同組蛋白的相互作用，以及各種蛋白因子的影響等有關。（1） 組蛋白的乙酰化 發(fā)生在N端堿性氨基酸集中區(qū)的賴氨酸和絲氨酸的殘基上；n 組蛋白乙酰化反應多發(fā)生在核心組蛋白N端堿性氨基酸集中區(qū)的特定Lys 殘基。于此，將乙酰輔酶A 的乙?；D移到Lys 的NH+3 ,中和掉一個正電荷. 這樣

36、可減弱DNA 與組蛋白的相互作用。 由組蛋白乙酰轉移酶催化； 降低核小體的穩(wěn)定性。（2） 組蛋白的磷酸化組蛋白H1是染色體凝集的主要蛋白；由于帶負電荷的磷酸基修飾了H1的絲氨酸和組胺酸的-OH基團，使之與DNA親和力下降，造成染色質疏松。（三）轉錄水平的調控 是基因表達調控的主要階段。 真核生物的RNA聚合酶不直接接觸啟動子，必須依賴轉錄因子與啟動子結合后方可進入啟動子區(qū)域參與轉錄起始復合物的組裝。 包括順式作用元件和反式作用因子。1. 順式作用元件1）啟動子：u RNA聚合酶的啟動子為例：u 存在于結構基因上游，與基因轉錄啟動有關的一段特殊DNA順序稱為啟動子（promoter)。u 核心啟

37、動子與原核生物類似，也含有一段富含TATA的順序，稱為TATA盒。除此之外，還可見CAAT盒和GC盒。啟動子元件啟動子中的元件可以分為兩種：u 核心啟動子元件u 上游啟動子元件核心啟動子元件指RNA聚合酶起始轉錄所必需的最小的DNA序列，包括轉錄起始點及其上游25/30bp處的TATA盒，和轉錄起始位點的起始子。核心元件單獨起作用時只能確定轉錄起始位點和產生基礎水平的轉錄。上游啟動子元件：包括通常位于70bp附近的CAAT框，GC框，八聚體（octamer），ATF結合位點 。這些元件與相應的蛋白因子結合能提高或改變轉錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表

38、達分別有不同的調控。順式作用元件的功能u 核心啟動子：決定轉錄的方向和精確的起始位點，只能引起低水平的轉錄。u 上游啟動子：影響轉錄起始的頻率、強度；主要通過各自結合的蛋白調控因子直接作用于基礎轉錄因子的靶位點，以增強轉錄起始復合物的組裝能力，但不具有組織特異性調控功能。2） 調控元件基因調控元件是指位于遠端調控區(qū)的順式作用元件，包括：增強子（enhancer)；沉默子（silencer)增強子（enhancer）：是指一些遠離轉錄起始點，能夠增強該基因轉錄活性的的調控元件。在真核生物中，增強子一般位于轉錄起始點上游-100bp以上，跨度為100200bp。它由多個獨立的、具有特征性的核苷酸序

39、列所組成，其中“核心”元件（element）常由812個bp組成；可以有完整的或部分的回文結構，并以單拷貝或多拷貝串聯(lián)的形式存在。u 增強子突出特點是： 增強轉錄效果明顯，可達200倍； 位置不固定，在轉錄起始點5或3側均能起作用，發(fā)揮作用與受控基因的遠近距離相對無關，不具有方向性，相對于啟動子的任一指向均能起作用； 通常具有一些短的重復順序，基本組件為8-12bp； 具有嚴格組織或細胞特異性； 沒有基因專一性，對同源或異源基因均有效； 可接受外部信號驅使，又被稱為反應元件。沉默子：能夠對基因轉錄起阻遏作用的DNA片段，屬于負性調控元件。 應答元件(response element)：是位于結

40、構基因上游能被特定轉錄因子識別和結合，從而調控專一性基因表達的DNA序列，如：u 熱激應答元件(heat shock response element，HSE)、u 金屬應答元件(metal response element，MRE)、u 糖皮質激素應答元件(glucor-ticoid response element，GRE)u 血清應答元件(serum response element，SRE)等。2. 反式作用因子：u 反式作用因子是能直接或間接地識別或結合在各順式作用元件核心序列上，并參與調控靶基因轉錄效率的一組蛋白質。u 真核生物的轉錄調控多數(shù)是通過反式作用因子與DNA順式作用元件的

41、相互作用來實現(xiàn)的。u 真核生物反式作用因子通常屬于轉錄因子（transcription factor，TF）。 轉錄因子的種類真核RNA聚合酶僅靠自身不能與啟動子結合，它們需要轉錄因子（主要是蛋白質）的協(xié)助轉錄因子有兩類通用轉錄因子（general transcription factors）（基本轉錄因子）以反式作用影響轉錄的因子可統(tǒng)稱為轉錄因子(TF)。RNA聚合酶是一種反式作用于轉錄的蛋白因子。通用轉錄因子能使聚合酶結合到啟動子上，形成預起始復合物（preinitiation complex），包括形成開啟的啟動子復合物（open promoter complex），但只能導致基礎水平的

42、轉錄。與RNA聚合酶、相應的轉錄因子分別稱為TF、TF、TF?；蛱禺愞D錄因子（gene-specific transcription factors）：能夠選擇性調控某種或某些基因轉錄表達的蛋白質因子稱為特異性轉錄因子。目前較清楚的是調控免疫球蛋白基因表達的核內蛋白質因子（NF），已發(fā)現(xiàn)存在NFA，NF2A，NFB，NFB4，NF等亞類。 轉錄因子的結構：目前已知，反式作用因子至少含有三個功能域，即：u DNA結合功能域，u 轉錄活性功能域u 其它轉錄因子結合功能域。 1） DNA結合域DNA結合域的核心部分為DNA結合基序，為蛋白質的一個肽段，可識別雙螺旋DNA的堿基序列。轉錄因子的某些區(qū)

43、段進入DNA雙螺旋的大溝或小溝，直接閱讀所識別的序列，并通過分子表面相互作用與DNA穩(wěn)定結合。(1) 螺旋-轉角-螺旋u 由兩段-螺旋夾一段-折迭構成，-螺旋與-折迭之間通過-轉角或成環(huán)連接，即螺旋-轉角-螺旋結構。(2)鋅指結構域（zinc finger motif）：是指由少數(shù)保守的氨基酸短肽鏈圍繞Zn2+離子折疊形成的一指狀結構。含有鋅指結構的蛋白質稱為鋅指蛋白。鋅指結構首先是在DNA結合區(qū)發(fā)現(xiàn)的，但在非DNA結合蛋白中也存在。目前已確認的鋅指結構有6種。(3)亮氨酸拉鏈結構：u 亮氨酸拉鏈是一種富含亮氨酸的蛋白鏈形成的二聚體基序。u 由兩段-螺旋平行排列構成，其-螺旋中存在每隔7個殘基

44、規(guī)律性排列的Leu殘基，Leu側鏈交替排列而呈拉鏈狀。兩條肽鏈呈鉗狀與DNA結合。 （4）螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)u 大部分以異二聚體形式存在：有一條含有兩個親水的-螺旋,鏈長為4050 aa，兩個-螺旋由很長的連接區(qū)形成的環(huán)相連；u 其結構與上述的亮氨酸拉鏈結構非常相似，只是在2個螺旋結構之間增加了一段非螺旋鏈結區(qū)（環(huán)），故稱為螺旋-環(huán)-螺旋結構。u 螺旋的一側有疏水氨基酸，兩條鏈依賴疏水氨基酸的相互作用形成同二聚體或異二聚體，u HLH通過螺旋疏水區(qū)形成二聚體，多數(shù)HLH蛋白還含有一個結合DNA所需要的堿性氨基酸區(qū)域。這種結構與螺旋-轉角-螺旋結構的差別在于它的兩個a螺旋的一側還有一段疏水

45、鏈，這樣, 當螺旋-環(huán)-螺旋結構位于兩個多肽之間時，這兩個疏水的側鏈就會將兩個多肽鏈連在一起形成類似亮氨酸拉鏈的結構。2） 轉錄激活域u 轉錄激活域是轉錄因子與其他蛋白分子相互作用的結構成份，具有控制轉錄起始復合物的組裝和轉錄起始的功能；u 轉錄激活域是反式作用因子中必須具備的結構基礎；u 它們與DNA的結合結構域在空間和功能上是分開的；u 一個反式作用因子上可含有多個轉錄活化結構域。酸性-螺旋結構域u 酸性一螺旋結構域(acidic -helix domain) 的結構特點是含有較多的負電荷,并能形成親脂性-螺旋（例：糖皮質激素受體；AP1/Jun轉錄因子。-螺旋的一側富含酸性氨基酸，另一側

46、為疏水性殘基；u 可與通用轉錄因子或RNA聚合酶本身結合，并有穩(wěn)定轉錄起始復合體的功能；u 活化區(qū)可與啟始復合物的成分(如TFII D因子或Pol II)相互作用而發(fā)揮其轉錄活化功能的。u 無明顯的序列同源性，但其功能相同。富含谷氨酰胺結構域u 它的結構特點是含有約25%的谷氨酰胺，而有極性的氨基酸卻很少。u 與酸性-螺旋結構域一樣，此結構之間也無明顯的序列同源性，且可能是可以相互替代的。如：SP1轉錄因子，酵母的HAP1、HAP2和GAL，哺乳動物的Oct-1、Oct-2、Jun、AP-2 和SRF等中也含有此結構。3. 轉錄起始復合物的形成在真核生物中，3種RNA聚合酶都不能直接與啟動子接

47、觸，只有當相關的轉錄因子在啟動子區(qū)構架了“平臺”后，聚合酶才能進入啟動子區(qū)參與轉錄起始復合物的組裝；通用轉錄因子: 在轉錄起始時首先與核心啟動子結合并組成轉錄起始基本裝置的調節(jié)蛋白，如TF D等，主要作用是將RNA聚合酶定位在啟動子上。轉錄激活因子：識別特定的共有元件，結合到啟動子或增強子短序列上，提高轉錄頻率。轉錄調節(jié)蛋白的主要功能激活因子可協(xié)助前起始復合物的組裝，并整合信息，以增強轉錄效率。u 在真核基因轉錄中，基因轉錄的起始除需要一系列的通用轉錄因子外，還要有其他轉錄調節(jié)蛋白，如激活因子、中介蛋白復合體等的協(xié)助，才能使RNA聚合酶組合到轉錄裝置上，并穩(wěn)定地結合于啟動子。u 在這一組合過程中，結合于DNA 的激活因子與轉錄裝置之間所發(fā)生的相互作用是借