包涵體的形成以及處理方法

1、包涵體的形成以及處理方法1 包涵體形成的原因(1)表達量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體L2。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達到足夠的溶解度等。(2)重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，真核糖蛋白無法糖基化使中問體溶解度下降，導(dǎo)致不溶解包涵體形成 。(3)重組蛋白分泌序列的存在阻礙折疊，導(dǎo)致錯誤折疊分子的產(chǎn)生。(4)重組蛋白的氨基酸組成，一般來說含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。(5)包涵體形成動力學(xué)研究表明，包涵體是由部分變性的中閫體聚合而成。因此，任何影響中間體穩(wěn)定的因素，如pH值(p

2、H接近蛋白的等電點時容易形成包涵體)離子強度和溫度都可以引起蛋白聚合反應(yīng)。(6)在細菌分泌的某個階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。(7)有報道認為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達，當培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體? 。包涵體的處理包涵體的形成具有有利的一面，也有不利的一面。有利的一面是包涵體的形成去除了幾乎全部的細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)。同時，因包涵體形成避免了蛋白水解酶對表達產(chǎn)物的降解而大大提高產(chǎn)率，通常其表達量可占菌體總蛋白的10 30 ，甚至高達50。不利的一面是溶解包涵體進行復(fù)性折疊的過程中需要加變性劑和去垢劑，而引起蛋白質(zhì)的不可逆修飾以及性質(zhì)改變，

3、這些試劑價格昂貴，且復(fù)性的操作過程不好控制；另一方面復(fù)性過程常伴有蛋白質(zhì)水解和沉淀，有些還形成異構(gòu)體【s 5。因此復(fù)性是蛋白質(zhì)工程中最關(guān)鍵、最復(fù)雜的問題。包涵體的處理一般有如下幾個步聚。破碎細菌細胞提取包涵體時，首先要裂解細菌，為了防止在裂解細菌的過程中目的蛋白質(zhì)變性，常常采取一些保護措施：合適的緩沖體系，如磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、檸檬酸緩沖液；加入保護劑，如還原劑DTT(2一巰基蘇糖醇)、2一巰基乙醇；加防止水解酶作用的試劑，如酶的抑制劑、EDTA(乙二胺四乙酸)。破菌的方法很多，主要包括以下幾種：(1)滲透破碎法：這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。(2)冷熱交替法：把待碎樣品投人

4、90 左右水中維持數(shù)分鐘后取出投入冰浴內(nèi)，可使大部分細胞破碎?？捎糜谔崛〉鞍踪|(zhì)和核酸。(3)反復(fù)凍融法：把待碎樣品冷卻到一2O ，凍固后取出，緩慢解凍，如此反復(fù)操作，細胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細胞脹破導(dǎo)致部分細胞及胞內(nèi)的顆粒破碎，但也可使生物活性物質(zhì)失活。這種方法雖簡單方便，但對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)卻不宜采用。(4)超聲波法：使用超聲波儀使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。根據(jù)不同待碎樣品采用不同頻率，不同時間；另外，超聲波處理時溶液溫度升高會使不耐熱的物質(zhì)失活，因此使用時為防止溫度升高，除間歇開機外，還需人工降溫。避免溶液內(nèi)存在氣泡，這樣會使蛋白質(zhì)變性【6】。(5)溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌

5、等微生物的細胞壁。在每毫升含2億個細胞的懸液中加100 g至1 mg溶菌酶，37 保溫10 min，或者室溫作用30 min，細胞就破壞了。洗滌包涵體洗滌包涵體前先8 000 rrain，412離心15 rain，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，利用洗滌液洗滌包涵體沉淀，常用去污劑Triton x一100或脫氧膽酸鈉和低濃度變性劑(如2 molL尿素或鹽酸胍等)洗滌以除去脂類，但過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包涵體溶解【 。溶解包涵體包涵體一般只溶于強的變性劑如尿素、鹽酸胍，它是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使

6、多肽伸展，SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等去垢劑，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，溶解一些包涵體蛋白質(zhì)【8。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如琉基乙醇、二硫基蘇糖醇(DTT)，常用濃度210 mM。另外，尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素68 M ，鹽酸胍57 M。一般來講，鹽酸胍溶解力強于尿素，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，但缺點是容易使SDSPAGE電泳條帶變形【9。尿素的溶解度為7O 90 ，其分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；貏e是在堿

7、性pH值下長期保溫時，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去尿素不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀，以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點，故目前已被廣泛采用。復(fù)性包涵體蛋白由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，加上劇烈的處理條件，使蛋白的高級結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白的復(fù)性特別必要。通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成1 。一般在尿素濃度4 M 左右時復(fù)性開始，到2 M左右時結(jié)束。對于鹽酸胍而言，從4 M 開始，到15 M 時復(fù)性過程結(jié)束 。包涵體蛋白的復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，除與控制蛋白質(zhì)復(fù)性的過程相關(guān)外，還在很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達到95以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M行復(fù)性的方法，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之幾，一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在2O左右【l 2。復(fù)性中常采用的方法有以下幾種：(1)稀釋復(fù)性法，直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制【13)。(2)透析復(fù)性法，好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)?！? 。(3)超濾復(fù)性，在生產(chǎn)中較