氨基酸含量的測定及分離鑒定

1、實驗七 氨基酸的分離鑒定,紙層析法,一 目的 通過氨基酸的分離，學習紙層析法的基本原理及操作方法 二 原理 紙層析法是利用各物質不同的分配系數(shù)，使混合物隨流動相時而得 到分離的方法。 紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的。濾紙纖維與水親和力較強，而與有機溶劑親和力弱，所以紙層析以濾紙纖維和結合水為固定相，以有機溶劑為流動相。當有機相沿濾紙流動經(jīng)過樣品點時，樣品點上的溶液在水相和有機相之間進行分配，樣品移動速率與樣品的極性及水親和力有關，因此，極性氨基酸移動較慢，而非極性氨基酸移動較快。 物質被分離后在紙層析圖上的位置用Rf值表示 Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿距離 在一定條件下某種物

2、質的Rf值是常數(shù),溶液前沿層析點 原點,溶劑前沿 苯丙氨酸 丙氨酸 天冬氨酸,器材 1 層析缸 2 毛細管 3 噴霧器 4 培養(yǎng)皿 5 層析濾紙,操作步驟 1 取層析濾紙一張，在紙的一端距邊緣2-3處用鉛筆劃一條直 線，在直線上約每隔3-4做一次記號，共記四次。 2 用毛細管將各種氨基酸樣品分別點在4個記號點上，干后再點 一次。盡量點成圓形，并在各點表上樣品名。 3 手通過紙將濾紙卷成圓筒形，并用針縫，共3針。每縫一針打 個結，第三針的線留長一點。 4 將縫好的紙（裝入）垂直放入裝有擴展劑的層析缸內(nèi)（點樣的 一端朝下，濾紙不應碰到缸壁） 5 約2個小時后，將濾紙取出，拆掉線后，放入烘干機內(nèi)烘干

3、，約10分 鐘后取出即顯色。 6 畫出溶液前沿線，確立個層析點中心，計算各氨基酸的Rf值,實驗結果:,原點到溶劑前沿距離為L，原點到層析點中心距離為d,氨基酸的定量分析 甲醛滴定法,一、目的： 初步掌握甲醛滴定法測定氨基酸含量的原理和操作要點,水溶液中的氨基酸為兼性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。甲醛可與氨基酸上的N+H3結合，形成NHCH2OH、N(CH2OH)2 等羥甲基衍生物，使N+H3上的H+游離出來，這樣就可以用堿滴定N+H3放出H+，測出氨基氮，從而計算氨基酸的含量。,二、實驗原理,若樣品中只含有單一的已知氨基酸，則可由此法滴定的結果算出氨基酸的含量。若樣品中含有多種氨基酸

4、（如蛋白質水解液），測不能由此法算出氨基酸的含量。 脯氨酸與甲醛作用后，生成的化合物不穩(wěn)定，導致滴定后結果偏低；酪氨酸含酚基結構，導致滴定結果偏高。,三、材料、試劑與器具,（一）試劑 1、0.5%酚酞酒精溶液 稱0.5g酚酞溶于100ml50%酒精中。 2、0.1mol/L甘氨酸溶液 取3.75g甘氨酸溶于500ml蒸餾水。 3、標準0.0200mol/L 氫氧化鈉溶液 4、中性甲醛溶液 取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示劑約3ml，滴加0.01mol/LNaOH溶液， 使溶液呈微紅色，臨用前中和。 （二）實驗器具 錐形瓶 、堿式滴定管、移液管洗耳球、天平 容量瓶、試劑瓶、量筒、玻棒與燒杯

5、,四、操作步驟,1、取5只50ml錐形瓶，按下表加入試劑。,2、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液變微紅色 注意：滴定管中溶液的初始位置和滴定結束時的位置； 滴定管的使用方法,3、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液變微紅色,4、記錄每次滴定所用的0.0200mol/L NaOH溶液的 體積,五、計算,標準甘氨酸氨基氮的回收率=,VNaoH*0.0200mol/L,理論計算值,*14.008,理論計算值:取用氨基酸的體積乘以濃度,再乘以14.008,VNaoH 兩次測定所用氨基酸的體積的平均值,每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克數(shù)為 式中：V1為滴定樣品消耗氫氧化鈉的體積（ml）； V2為滴空白消耗氫氧化鈉的體積（ml）； MNaOH 標準NaOH溶液的摩爾濃度,1、甲醛法測定氨基酸含