WB實(shí)驗(yàn)組織總蛋白提取方法

1、WB實(shí)驗(yàn)組織總蛋白提取方法WB組織總蛋白提取步驟第一步提取組織蛋白上清液1，準(zhǔn)備裂解液（1）溶PMSF（將PMSF晶體溶到PMSF溶劑中，即配成10ml100mM的PMSF液體）（2）裂解液的制備組成：PIRA裂解液+PMSF溶劑+蛋白酶抑制劑10mlPIRA=100ulPMSF=1片蛋白酶抑制劑（3）將配好的裂解液放在4備用。2，研磨組織（心尖）（1）準(zhǔn)備研缽，藥勺（2把），長鑷子，保溫箱（里面放入冰塊），湯勺，離心管，天平，手套（2幅），液氮，冰盤，振蕩器。（2）將所有接觸到組織的工具用液氮預(yù)冷。（3）1人負(fù)責(zé)將組織組織給研磨者并隨時(shí)加液氮（此人必須記住每次研磨者所研磨的組織的編號）2人研

2、磨組織（多次快速），同時(shí)一人將1.5ml離心管編號預(yù)冷去皮。（4）將研磨好的組織放在去皮處理的對應(yīng)的離心管中稱重。（用大白紙記錄好每個(gè)樣的重量，便于離心時(shí)配平用）。（5）加裂解液（1mg組織加6ul裂解液）。（6）震蕩混勻后放入冰盤上，等所有的樣加完后一齊在搖床上搖1h。3，離心提取蛋白上清液（1）提前30min預(yù)冷離心機(jī)（4）。（2）配平。（3）離心，按照配平時(shí)的組放樣（13000r，5min）。（4）取上清液，儲存在-20備用。（提前將1.5ml的離心管編號）。第二步BCA法測蛋白濃度1，37預(yù)熱水浴箱2，配蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（1）準(zhǔn)備9個(gè)1.5ml離心管并編號A,B,C,D,E,F,G,H,I（

3、2）按照說明書配制標(biāo)準(zhǔn)樣。3，將蛋白上清液稀釋十倍（1）準(zhǔn)備0.5ml的離心管并編號。（2）取上清液6ul，然后加入54ul蒸餾水，震蕩混勻。2，配BCA工作液Ragent A：B=50:1工作液所需用量計(jì)算：總體積=（n待測樣+9標(biāo)準(zhǔn)樣）2200ul其中A液xx，B液xx。3，向酶標(biāo)板（96孔板）中加入蛋白和工作液先加25ul蛋白，再加200ul工作液，每個(gè)樣加兩個(gè)孔。96孔板視圖1234567891011124，加完工作液后搖床搖30min，放入37水浴30min。（最好蓋上蓋）5，預(yù)熱酶標(biāo)儀376，酶標(biāo)儀使用方法（1）打開MPM6軟件（2）File-New（3）文件-Intrument-

4、Setup-Single-波長562nm-OK（4）File-Read new plate（5）Expert Date：Max7，根據(jù)OD值的平均數(shù)用EXCEL計(jì)算濃度（記得x10）。第三步制備上樣蛋白1，計(jì)算500ul上樣蛋白組成蛋白上清液+1x樣緩（固定5x樣緩100ul）+超純水（可用蒸餾水代替）（1）計(jì)算500ul上樣量所需的蛋白體積V蛋白=2ug/ul500ul/實(shí)際蛋白濃度（ug/ul）（注意：2ug/ul可以根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整的）（2）計(jì)算所需超純水體積V水=500-100-V蛋白（3）數(shù)據(jù)用excel計(jì)算并提前打印。2，準(zhǔn)備1.5ml的離心管編號。3，將提前將5x樣緩取出解凍。4，按照excel表中數(shù)據(jù)在離心管中加入蛋白上