Western Blot實驗方法

1、Western Blot實驗方法一、溶液配制1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10 ml稱取NaF 41.99mg，超純水8ml溶解后定容至10ml2.30%聚丙烯酰胺凝膠液（交聯(lián)度3%）：100ml丙烯酰胺29 gN,N-甲叉雙丙烯酰胺 1 g加去離子水至100 ml 混勻,棕色瓶中避光保存3.0.01mol/L 乙酸鈉NaOAc（pH 5.2）（MW=136.08）25ml136.080.012510-3=34 mg，稱取34 mg乙酸鈉，加入20ml蒸餾水，待其溶解后，乙酸調(diào)pH值至5.2，再定容至25ml。4.1M DTT 10 mlDTT(二硫蘇糖醇) 1.545

2、g0.01mol/L 乙酸鈉（pH 5.2）8ml溶解后定容至10ml，0.22m濾膜抽濾。5.4SDS-PAGE Loading Buffer 10ml0.2M Tris-HCl(pH=6.8) 1M 4 ml8% SDS 10% 0.8 g0.4% 溴酚藍(lán)40 mg40% Glycerol 4 ml三蒸水定容至10 ml0.4M DTT 臨用前1M貯存液按400 l/ ml比例加入上述溶液中。6. 1.5M Tris(pH 8.8) 100 mlTris 18.171 g加入三蒸水80 ml，溶解后加入濃HCl調(diào)pH值至8.8，定容至100ml7.1M Tris(pH 6.8) 100 m

3、lTris 12.114 g加入三蒸水80 ml，溶解后加入濃HCl調(diào)pH值至6.8，定容至100ml8.1電泳緩沖液：1000 ml0.25M Tris 3 g0.19M Glycine 14.4 g0.1% SDS 1g三蒸水定容至1000 ml9.1Transfer Buffer：1000 ml0.25M Tris 3 g0.19M Glycine 14.4 g三蒸水定容至900 ml使用前加入甲醇100ml10.PBS Buffer137 mM NaCl 8g2.7 mM KCl 0.2 g10 mM Na2HPO4 1.44 g2 mM KH2PO4 0.24 g三蒸水定容至1000

4、 ml調(diào)節(jié)pH值至7.4，高壓滅菌，4保存11.PBST Buffer500 ml PBS中加入250 l Tween-20。12.RIPA細(xì)胞裂解緩沖液(100 ml)終濃度Tris 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4)NaCl 0.87 g 150 mMEDTA 37.22 mg 1 mMNP-40 1 ml 1%SDS 0.1 g 0.1%脫氧膽酸鈉0.5 g 0.5%溶解于80 ml超純水中，待溶解后加入HCl調(diào)pH值至7.4，定容至100 ml。常規(guī)裂解細(xì)胞時，于使用前加入儲存濃度終濃度PMSF 100 mM 10l/1ml 1 mMNaF 100 mM 10l/1ml 1 m

5、MAprotinin 10g/l0.2l/1ml 2g/lLeupetin 10g/l0.2l/1ml 2g/l二、Western Blot1. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）(1)制備濃縮膠和分離膠：根據(jù)蛋白大小選擇合適的分離膠濃度(2)灌膠：按照儀器使用說明安裝好垂直板SDS聚丙烯酰胺凝膠制膠裝置，迅速在兩層玻璃板間灌入分離膠（距頂端約 1.5cm）, 并在膠面上用少量蒸餾水覆蓋；待分離膠聚合完全后,用濾紙吸去凝膠表面的蒸餾水，再灌入濃縮膠, 插入干凈的梳齒, 待濃縮膠聚合完全后，安裝好電泳槽，將1SDS-PAGE緩沖液倒入電泳槽，拔出梳齒，用電泳緩沖液沖洗加樣孔。(3)上

6、樣：以5 l 中分子量蛋白標(biāo)志物作為參照，取蛋白液20 g30 g上樣（后期實驗發(fā)現(xiàn)使用放射自顯影方法時，上樣量20g即可）。(4)電泳：恒壓方式，80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)至110V。當(dāng)示蹤劑到達(dá)分離膠底部時結(jié)束電泳，約22.5h2. Western Blot(1)轉(zhuǎn)膜取2張海綿及兩張與Whatman 3M濾紙及一張硝酸纖維素膜（NC膜）浸泡于適量Western Blotting轉(zhuǎn)移緩沖液中3至5 min。將海綿、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜及另外濾紙、海綿放置好，注意使各層之間不留有氣泡。接通電源，350 mA 濕轉(zhuǎn)100min2h（根據(jù)蛋白大小選擇，一般100min足夠），如為一張膜

7、則選擇150mA 2h。（層次如下圖）(2)封閉NC膜取出，PBST清洗，5min/次，共3次，將NC膜浸入適量的封閉液（5%脫脂奶粉，溶于PBST，約50 ml）中，室溫震蕩1-2小時后4放置過夜。(3)抗原抗體反應(yīng)以PBST清洗NC膜3次，5min/次，剪下目的蛋白所在區(qū)域，將其置入一雜交袋中，加入稀釋的一抗23 ml（用封閉液稀釋一抗），將雜交袋封閉，37 23小時。剪開雜交袋，以PBST清洗NC膜4次，5分鐘/次。加入稀釋二抗6 ml10ml，根據(jù)膜多少調(diào)整，（用封閉液稀釋二抗），室溫振蕩2小時。(4)放射自顯影取出NC膜，以PBST清洗4次，515分鐘/次（根據(jù)顯影后背景調(diào)整洗膜時間，背景深則延長清洗時間），再用PBS清洗1次，NC膜放在一張干凈濾紙上，干燥后，將其平鋪于保鮮膜上，蛋白面向上，將放射自顯影工作液（按試劑盒操作說明配置成工作液）滴于膜上，12min后，將顯影液控干，封于保鮮膜，放入X片盒中。暗室中，放入膠片，曝光15min，顯影液中顯影30sec，定影。三實驗中問題1.曝光出來后,背景都是黑的,而目的條帶是透明原因：信號太強(qiáng)，瞬間淬滅了，在背景的襯托下，目的條帶的位置反白?？梢越档蜕蠘恿炕蛘{(diào)整一抗和二抗的用量及孵育時間。2.顯影后背景很深，條帶不清晰。解決方法：上樣量不