轉(zhuǎn)免疫學(xué)實驗課件

1、轉(zhuǎn) 免疫學(xué)實驗課件免疫學(xué)實驗課件生化與免疫學(xué)實驗室中性粒細(xì)胞的吞噬作用【實驗?zāi)康摹?.熟悉中性粒細(xì)胞吞噬實驗的原理和方法。2.通過本實驗理解機體的非特異性免疫機制?！緦嶒炘怼恐行粤＜?xì)胞具有吞噬殺菌功能，當(dāng)與顆粒性物質(zhì)(如葡萄球菌等)混合孵育一定時間后，顆粒性物質(zhì)被吞噬殺滅，根據(jù)吞噬率、吞噬指數(shù)可反映該細(xì)胞的吞噬功能?！緦嶒灢牧稀?.表皮(白色)葡萄球菌菌液(濃度610億/ml)。2.肝素溶液(25U/ml)；甲醇，堿性美藍(lán)(或瑞氏)染液。3.血紅蛋白吸管，凹玻片，載玻片，采血針，微量加樣器，濕盒，顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，75%酒精，棉簽，香柏油，二甲苯等。【實驗方法】1、用微量加樣器，吸取肝素2

2、0ul加入潔凈凹玻片凹孔內(nèi)。2、用酒精棉簽消毒手指后，刺破皮膚，以血紅蛋白吸管取血40ul，立即放入盛有肝素的凹玻片凹孔內(nèi)，并充分混勻。3、用微量加樣器取葡萄球菌菌液20ul加入上述凹玻片凹孔內(nèi)，充分混勻。4、將凹玻片置于濕盒內(nèi)，30溫箱中30min，其間每隔10min搖勻一次。5、取一小滴上述混合液，置于載玻片上，用另一載玻片推成薄血片，待干。6、滴加甲醇固定3min，水洗。7、加堿性美藍(lán)染色12min，水洗，印干。8、置油鏡下觀察吞噬和未吞噬的白細(xì)胞并計數(shù)?！緦嶒灲Y(jié)果】【實驗思考】1、在吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌時，如何區(qū)別吞噬的細(xì)菌和粘附在吞噬細(xì)胞表面的細(xì)菌?2、簡述機體非特異性免疫的概念及特點

3、。凝集反應(yīng)【實驗?zāi)康摹?.了解凝集反應(yīng)的原理、基本類型及其臨床意義。2.掌握玻片凝集實驗、間接凝集實驗的實驗方法和結(jié)果分析。【概述】在一定濃度的電解質(zhì)溶液中，顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，稱為凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)是一種定性的檢測方法，也可以進(jìn)行半定量檢測。凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)。由于凝集反應(yīng)方法簡便，目前在臨床檢驗中仍被廣泛應(yīng)用。一、直接凝集反應(yīng)細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng)。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。玻片凝集試驗-ABO血型鑒定玻片凝集試驗為定性試驗，一般用已知抗體作為診斷血清，與受檢顆粒

4、抗原，如菌液或紅細(xì)胞抗原各加一滴在玻片上，混勻，數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結(jié)果，出現(xiàn)凝集顆粒的為陽性。此法簡便，快速，適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型，也可用于紅細(xì)胞ABO血型的鑒定。【實驗原理】人類ABO血型抗原主要有A和B兩種，根據(jù)紅細(xì)胞表面這兩種抗原的有無可把血型分為四種。據(jù)此，將抗A和抗B抗體分別與待測紅細(xì)胞混合，抗A或(和)抗B抗體與紅細(xì)胞表面上的相應(yīng)抗原結(jié)合而引起紅細(xì)胞凝集，據(jù)其凝集情況便可判定出受試者的血型。ABO血型的劃分【實驗材料】1.ABO血型鑒定試劑盒內(nèi)含抗A分型試劑和抗B分型試劑各1支。2.一次性采血針1枚、潔凈玻片2塊、75%酒精、滅菌棉簽。3.84消毒液

5、3.用酒精棉簽消毒被檢者手指尖端，以采血針刺破皮膚，稍加擠壓，使血液流出。用另一載玻片一端取適量血液加入抗抗A分型試劑，并混勻；用另一端再取適量血液加入抗抗B分型試劑，并混勻。用干棉簽止血。4.觀察紅細(xì)胞有無凝集發(fā)生。如有凝集，可見紅細(xì)胞凝集成塊；無凝集，紅細(xì)胞呈均勻分散。判定結(jié)果后把玻片放入消毒液中。二、間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原或抗體先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體表面(這種載體與免疫無關(guān))，然后與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，在適量的電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。根據(jù)載體的不同可將間接凝集反應(yīng)分為：間接血細(xì)胞凝集試驗、間接乳膠凝集試驗(及間接乳膠凝集抑制試驗)和金黃色葡萄球菌協(xié)同凝

6、集試驗等。間接凝集抑制試驗-妊娠試驗【實驗原理】可溶性抗原致敏的乳膠顆粒與相應(yīng)抗體作用可使乳膠顆粒凝集，此為間接乳膠凝集試驗。若使抗體先與可溶性抗原作用，再加入該抗原致敏的乳膠顆粒，則乳膠凝集被抑制，此為間接乳膠凝集抑制試驗。孕婦尿中絨毛膜促性腺激素(HCG)含量明顯增高。HCG與抗HCG抗體先作用后，再加入HCG致敏的乳膠顆粒，不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，此為妊娠試驗陽性；非孕婦尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗體，抗體與后加入的HCG致敏乳膠結(jié)合呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則妊娠試驗陰性?！緦嶒灢牧稀?.妊娠診斷試劑盒：內(nèi)含抗血清(抗HCG)、乳膠抗原(HCG致敏)各一支2.待檢尿、孕婦尿、正常尿。3.有格玻片和

7、毛細(xì)吸管等?！緦嶒灧椒ā?.在玻片的第1、第2和第3格內(nèi)分別加1滴正常尿、待檢尿及孕婦尿。2.每格內(nèi)加入妊娠診斷試劑抗血清1滴。輕輕搖動12 min使其充分混勻。3.每格加入乳膠抗原1滴，輕輕搖動玻片35 min后觀察結(jié)果，記錄各標(biāo)本有無凝集現(xiàn)象?！緦嶒灲Y(jié)果】孕婦尿格呈均勻渾濁乳狀液，無凝集，妊娠試驗陽性；正常尿格出現(xiàn)白色細(xì)小凝集物，隨時間延長凝集物變成小塊狀，妊娠試驗陰性。待檢尿若為乳狀液，妊娠試驗陽性；若出現(xiàn)凝集，則妊娠試驗陰性?！咀⒁馐马棥?.試驗所用診斷試劑用前應(yīng)充分搖勻，而且應(yīng)在有效期內(nèi)使用。2.加樣用的滴管及混勻用的牙簽不能共用。3.加樣不宜太多，玻片應(yīng)始終保持水平，以防兩格之反應(yīng)

8、液相混。【實驗思考】1.記錄血型鑒定試驗、乳膠妊娠診斷試驗的材料、方法及結(jié)果判定(可用圖示或表格方式表示)。2.直接凝集試驗與間接凝集試驗有何不同?3.在各凝集試驗中都設(shè)有相應(yīng)對照，有何意義?若對照出現(xiàn)異常如何分析及解決?沉淀反應(yīng)【實驗?zāi)康摹?.掌握對流免疫電泳的基本原理、方法。2.熟悉瓊脂單向擴散，雙向擴散的基本原理、方法、結(jié)果分析及臨床用途。3.了解火箭免疫電泳的基本原理、方法?！靖攀觥靠扇苄钥乖缪?、毒素、細(xì)菌浸出液等與相應(yīng)抗體結(jié)合，當(dāng)兩者比例合適、并有適量電解質(zhì)存在時，形成肉眼可見的沉淀物或沉淀線，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)是臨床上最常用、最基本的方法之一。它的種類較多，可分為瓊脂擴散試

9、驗、免疫電泳試驗、環(huán)狀沉淀試驗及絮狀沉淀試驗等。一、瓊脂擴散試驗利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂內(nèi)進(jìn)行擴散，當(dāng)兩者比例合適時，就出現(xiàn)白色沉淀線，為陽性反應(yīng)。本試驗可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂內(nèi)進(jìn)行操作。瓊脂擴散試驗可分為單向瓊脂擴散試驗和雙向瓊脂擴散試驗。(一)單向瓊脂擴散試驗(示教)(二)雙向瓊脂擴散實驗(示教)二、對流免疫電泳【實驗原理】帶電的膠體顆?？稍陔妶鲋幸苿?，移動方向與膠體顆粒所帶電荷有關(guān)。多數(shù)蛋白質(zhì)抗原在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在電泳時從負(fù)極向正極移動?？贵w屬球蛋白，在堿性緩沖液只帶微弱的負(fù)電荷，而且相對分子質(zhì)量較大，電泳力較小，在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負(fù)極移動。這

10、樣就使抗原和抗體定向?qū)α鳎趦煽组g相遇時發(fā)生反應(yīng)，并在比例合適處形成肉眼可見的白色沉淀線。這種將雙向瓊脂擴散和電泳技術(shù)結(jié)合在一起的方法稱為對流免疫電泳。【實驗材料】1.電泳緩沖液：pH 8.6巴比妥-鹽酸緩沖液。2.抗體：抗AFP。3.抗原：AFP陽性血清、待檢病人血清。4.1%瓊脂用pH 8.6巴比妥-鹽酸緩沖液配制，冰箱保存?zhèn)溆谩?.電泳儀、電泳槽、載玻片、打孔器、10 ml吸管、移液器、移液頭。【實驗方法】1.制板2.打孔3.加樣將抗原加入瓊脂板上有標(biāo)記孔側(cè)的小孔中，抗體加入另一側(cè)小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。(如圖示)4.電泳將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側(cè)置陰極端，抗體孔側(cè)置

11、陽極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓610 V/cm板長，電泳約3060 min。5.關(guān)閉電源，取出瓊脂板，觀察結(jié)果。【實驗結(jié)果】將玻片對著強光源，先觀察AFP陽性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線，然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現(xiàn)，如有沉淀線，則表示AFP試驗陽性，否則AFP試驗為陰性?！咀⒁馐马棥?.電泳時電流不宜過大，以免蛋白變性。2.抗原和抗體的電極方向不能搞錯。3.抗原和抗體的濃度要適當(dāng)，抗原太濃或太稀都不易出現(xiàn)沉淀線。4.電泳所需時間與孔間距離有關(guān)，距離越大，電泳時間越長。【實驗思考】1.單向擴散與火箭電泳、雙向擴散與對流免疫電流比較各有何特點?2.對流免疫電泳中，抗

12、原為何放陰極端，抗體為何放陽極端?外周血單個核細(xì)胞的分離【實驗?zāi)康摹?.熟悉免疫細(xì)胞分離的常用方法。2.掌握外周血單個核細(xì)胞分離方法的原理、操作規(guī)程。【實驗原理】人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。單個核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細(xì)胞不同。因此利用一種介于1.0751.090之間而近于等滲的聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細(xì)胞在分離液中呈梯度分布。從而分離出PBMC?！緦嶒灢牧稀?.肝素溶液用生理鹽水將肝素配成125250 U/ml的溶液，置

13、4下保存?zhèn)溆谩?.淋巴細(xì)胞分層液市售或自配，20時密度應(yīng)為(1.0770.001)g/L。3.Hanks平衡鹽溶液(HBSS)或磷酸鹽緩沖液(PBS)pH 7.27.4。4.完全RPMI-1640培養(yǎng)液。5.15 ml或50 ml錐底離心管。6.水平離心機，顯微鏡。7.玻璃吸管，滴管，細(xì)胞計數(shù)板等。8.2%臺盼藍(lán)染液?！緦嶒灧椒ā?.采集靜脈血若干毫升(隨需要而定)，注入盛有肝素的無菌小瓶中(每ml全血加0.1 ml肝素溶液)，加蓋后立即輕輕搖勻，使血液抗凝。2.用吸管加入等體積的室溫HBSS或PBS，使血液等倍稀釋。(此步驟亦可省去)3.吸取淋巴細(xì)胞分層液(每10 ml稀釋血加5 m1分層液

14、)置于15 m1或50 m1離心管中，然后將離心管傾斜45角，將稀釋血液在距分層液界面上1 cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面。應(yīng)注意保持兩界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。5.用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色層，沿管壁輕輕吸出該層的單個核細(xì)胞，盛入另一支離心管中。6.將所得到的PBMC懸液用5倍體積的HBSS或RPMI-l640洗滌2次，依次以2 000 r/min，1500 r/min在室溫(1825)下離心10 min，棄上清。7.用完全RPMI-1640定容細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞后再調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。8.用臺盼藍(lán)染液檢查所分離細(xì)胞的活性：取2滴細(xì)胞懸液加1滴2%臺盼藍(lán)染液，510 min后取樣作濕片高倍

15、鏡檢?！緦嶒灲Y(jié)果】臺盼藍(lán)染液檢查活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。計數(shù)200個細(xì)胞，計算活細(xì)胞百分率，一般活性應(yīng)在95%以上。【注意事項】1.與血液樣品接觸時應(yīng)注意安全防護(hù)，避免血源性傳染病傳染。2.操作應(yīng)輕柔，細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻，避免損傷細(xì)胞活性及細(xì)胞丟失。3.細(xì)胞分層液在室溫下應(yīng)為(l.0770.001)g/L；應(yīng)避光4下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用。使用中應(yīng)避免細(xì)菌污染。4.稀釋血液可降低紅細(xì)胞的凝集，提高淋巴細(xì)胞收獲量，但如果要保留血漿成分作其他實驗用時，則不能稀釋血液，以免影響血漿成分。免疫系統(tǒng)組分的分離及活性檢測【實驗?zāi)康摹?.掌握免疫系統(tǒng)組分中胸腺、脾組織結(jié)構(gòu)及淋巴細(xì)胞的

16、功能。2.熟悉淋巴細(xì)胞分離方法。3.建立對免疫學(xué)的整體概念，加深對免疫系統(tǒng)組成和功能及重要性的理解，提高學(xué)習(xí)興趣及主動性。4.培養(yǎng)學(xué)生在實際工作中動手、動腦、觀察和分析與解決問題的能力。一、小鼠胸腺、脾摘除術(shù)【實驗原理】小鼠的胸腺和脾是研究T細(xì)胞和B細(xì)胞特性與功能最主要的材料來源。觀察其組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)目及活性等，可進(jìn)一步了解該機體的免疫狀況。是目前探討免疫學(xué)理論及與其有關(guān)疾病的最好模型之一。故摘除胸腺和脾是進(jìn)行研究的前提?！緦嶒灢牧稀?.昆明種小鼠2024 g。2.75%酒精、無菌棉簽。3.小手術(shù)臺、大頭針、眼科鑷子、剪子?！緦嶒灧椒ā?.取小鼠一只以眼球采血(抗凝備用)處死。2.小鼠用大頭

17、針固定在小手術(shù)臺上，位置擺正。3.用75%的酒精消毒小鼠皮膚。4.打開腹腔及分離胸骨后軟組織。5.用眼科剪從腹部向上沿正中線剪開胸骨到頸部。6.暴露胸腺后輕輕剝離兩葉胸腺。7.在上腹部剝離脾，剪除結(jié)締組織被膜?！緦嶒灲Y(jié)果】觀察胸腺、脾組織結(jié)構(gòu)及其是否完整。有時間可在電子天秤稱重?！咀⒁馐马棥?.剝離胸腺時要特別小心，以保證兩葉完整性。2.剝離胸腺、脾時要完全去掉其他組織。二、小鼠淋巴細(xì)胞分離及活性檢測實驗原理、材料、方法及結(jié)果略，與前述外周血單個核細(xì)胞分離基本相同，不同之處：1.小鼠淋巴細(xì)胞的密度為1.098 g/ml，故分層液的密度不同。2.取胸腺、脾經(jīng)200目鋼絲網(wǎng)過篩的細(xì)胞懸液，用分離層

18、液分離淋巴細(xì)胞。3.取眼球血液用分層分離淋巴細(xì)胞?！緦嶒炈伎肌?.為什么取胸腺和脾制備淋巴細(xì)胞，可了解機體的免疫功能?2.如何理解機體免疫系統(tǒng)各組成部分功能正常的重要性?3.分離淋巴細(xì)胞的意義何在?4.為進(jìn)一步了解機體免疫功能還需進(jìn)行哪些檢測?免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用有機結(jié)合的一種方法。它以酶作為標(biāo)記物，與抗體(或抗原)聯(lián)結(jié)，與相應(yīng)的抗原(或抗體)作用后，通過底物的顏色反應(yīng)作抗原抗體的定性和定量，亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究，即酶免疫組織化學(xué)技術(shù)。目前應(yīng)用最多的免疫酶技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)，它是將可溶性抗原(或抗體)吸附于固相載體上，加

19、入酶標(biāo)抗體(或抗原)與吸附在載體上的抗原(或抗體)結(jié)合，形成酶標(biāo)記復(fù)合物，再加入酶底物時，即可顯色。顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量相關(guān)。常用的酶有辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)，相應(yīng)的底物分別是鄰苯二胺(OPD)和對硝基苯磷酸鹽。實驗方法有間接法、夾心法和競爭法。一、ELISA夾心法檢測HBsAg【實驗?zāi)康摹?.熟悉ELISA的原理、夾心法。2.了解免疫標(biāo)記技術(shù)的原理?！緦嶒炘怼坎捎枚嗫寺】?HBS包被反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本，同時加入單克隆抗-HBs-HRP，如待測標(biāo)本中含有HBsAg時就與包被抗-HBs、抗-HBs-HRP結(jié)合形成復(fù)合物，加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無顯色反應(yīng)。【