質(zhì)粒提取原理及步驟

1、For personal use only in study and research; not for commercial use質(zhì) 粒 提 取 原理及步驟一、導(dǎo)論 已經(jīng)提出過(guò)許多方法用于從細(xì)菌中提純質(zhì)粒DNA， 這些方法都含有以下3個(gè)步驟：1. 細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。2. 細(xì)菌的收獲和裂解3. 質(zhì)粒DNA的純化。（一）細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)從瓊脂平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng))，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此?，F(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn)LB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此

2、時(shí)，不必造反性地?cái)U(kuò)增質(zhì)粒DNA。然而，較長(zhǎng)一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí)，以便對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行性擴(kuò)增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時(shí)內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來(lái)，加入足以完全抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素g/ml)已成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量，對(duì)于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。（二）細(xì)菌的收獲和裂解細(xì)菌的收獲可通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則可

3、以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對(duì)質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出精確的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來(lái)選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。1)大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來(lái)。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來(lái)所需要的作用力。2)可用更劇烈的方法來(lái)分離小質(zhì)粒。

4、在加入EDTA后，有時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過(guò)煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。3)一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放相對(duì)大量的糖類，當(dāng)隨后用氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)它們會(huì)惹出麻煩。糖類會(huì)在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等

5、大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時(shí)，不宜使用煮沸法。4)當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制備質(zhì)粒時(shí)，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒芡耆珳缁顑?nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時(shí)，質(zhì)粒DNA會(huì)被降解。但如果通過(guò)一個(gè)附加步驟(用酚：氯仿進(jìn)行抽提)可以避免此問(wèn)題。)目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來(lái)煞為費(fèi)事，而在對(duì)數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時(shí)從

6、較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時(shí)從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。(三)質(zhì)粒DNA的純化常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。例如，用氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過(guò)嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和( 每個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合個(gè)溴化乙錠

7、分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來(lái)，氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。然而該過(guò)程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、分級(jí)沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。本實(shí)驗(yàn)室采用離子交換層析法已可得到極高純度的質(zhì)粒。二、質(zhì)粒DNA的小量制備質(zhì)粒的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法（一）細(xì)菌的收獲和裂解收獲）將2ml含相應(yīng)抗生素的加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。）將1.5ml培養(yǎng)物

8、倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4。）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。堿裂解法）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100l用冰預(yù)冷的溶液中，劇烈振蕩。溶液:50mmol/L葡萄糖25mmol/L TrisCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4。須確使細(xì)菌沉淀在

9、溶液中完全分散，將兩個(gè)微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。）加200l新配制的溶液。溶液0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）1%SDS蓋緊管口，快速顛倒離心管次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。）加150l用冰預(yù)冷的溶液 溶液5mol/乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L。蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上分鐘。）用微量離心機(jī)于412 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中

10、。）可做可不做：加等量酚：氯念， 振蕩混勻， 用微量離心機(jī)于4 以12000g離心分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不必用酚：氯仿進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會(huì)得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。）用倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置分鐘。）用微量離心機(jī)于4以12 000g離心分鐘。）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。）用1ml70%乙

11、醇于4洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。i. 此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如f3或pUC），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物35g。ii如果要通過(guò)限制酶切割反應(yīng)來(lái)分析DNA，可取1l DNA溶液加到另一含l水的微量離心管內(nèi)，加1l 10限制酶緩沖液和單位所需限制酶， 在適宜溫育12小時(shí)。將剩余的DNA貯存于20。iii. 此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物：煮沸裂解）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350l STET中。STET0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)5% Tr

12、iton X-100）加25l新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。）將離心管放入煮沸的水浴中，時(shí)間恰為40秒。）用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分種。）用無(wú)菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。）在上清中加入40l 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420l異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。）用微量離心機(jī)于4以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使

13、用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管的液滴。）加1ml 70乙醇，于4以12 000g離心分鐘。10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r(shí)沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無(wú)可見的液體（25）分鐘。11）用50l含無(wú)DNA酶的胰RNA酶（20g/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20。注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時(shí)，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不

14、能完全滅活內(nèi)切核酸酶，以后在Mg2+存在下溫育（V中用限制酶時(shí)）質(zhì)粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟）之間增加一步，即用酚：氯仿進(jìn)行抽提，可以避免這一問(wèn)題。（二）質(zhì)粒小量制備的問(wèn)題與對(duì)策裂解和煮佛法都極其可靠，重復(fù)性也很好，而且一般沒(méi)有會(huì)么麻煩。多年來(lái)，在我們實(shí)驗(yàn)室中日常使用這兩種方法的過(guò)程中，只碰到過(guò)兩個(gè)問(wèn)題：）有些工作者首次進(jìn)行小量制備時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細(xì)菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時(shí)注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對(duì)溶液進(jìn)行抽提可以去除小量備物中的雜質(zhì)。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。）在十分偶然的情況下，個(gè)別小時(shí)制備物

15、會(huì)出現(xiàn)無(wú)質(zhì)粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。三、質(zhì)粒的大量制備（一）在豐富培養(yǎng)基中擴(kuò)增質(zhì)粒許多年來(lái)，一直認(rèn)為在氯霉素存在下擴(kuò)增質(zhì)粒只對(duì)生長(zhǎng)在基本培養(yǎng)基上的細(xì)菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復(fù)制子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chǎn)量至每500ml培養(yǎng)物25mg質(zhì)粒DNA，而且重復(fù)性也很好。）將30ml含有目的質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)晚期（DNA 600約0.6)。培養(yǎng)基中應(yīng)含有相應(yīng)抗生素，用單菌落或從單菌落中生長(zhǎng)起來(lái)的小量液體閉關(guān)物進(jìn)行接種。）將含相應(yīng)抗生素的500ml 或Terrific肉湯培養(yǎng)基（預(yù)加溫至37）施放入25ml對(duì)數(shù)晚期的培

16、養(yǎng)物，于37劇烈振搖培養(yǎng)25小時(shí)（搖床轉(zhuǎn)速300轉(zhuǎn)/分），所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170g/ml。像pBR322一類在宿主菌內(nèi)只以中等拷貝婁竿行復(fù)的質(zhì)粒，有必要通過(guò)擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到餉新一代的質(zhì)粒（如pUC質(zhì)粒）可復(fù)制達(dá)到很高的拷貝數(shù)，因此無(wú)需擴(kuò)增。這些質(zhì)粒只要從生長(zhǎng)達(dá)到飽和的細(xì)菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進(jìn)行處理，具有抑制細(xì)菌復(fù)制的優(yōu)點(diǎn)，可減少細(xì)菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡(jiǎn)化質(zhì)粒純化的過(guò)程。所以一般說(shuō)來(lái)，盡管要在生長(zhǎng)中的細(xì)菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。）于37

17、劇烈振搖（300轉(zhuǎn)/分），繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí)。（二）細(xì)菌的收獲和裂解收獲）用合適轉(zhuǎn)頭于4以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。）將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中。STE0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)）按步驟）所述方法離心，以收集細(xì)菌細(xì)胞。，堿裂解法）將冼過(guò)的500ml 培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物 來(lái)自收獲細(xì)菌的步驟3 重懸于10ml（18ml）溶液中。溶液:50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液

18、可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于。）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。當(dāng)溶液的pH值低于8.0時(shí)，溶菌酶不能有效工作。）加20ml(40ml)新配制的溶液。溶液:0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）1SDS蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。）加15nl(20ml)用冰預(yù)冷的溶液。溶液:5mol/L乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液對(duì)鉀是mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L

19、。封住瓶口，搖動(dòng)離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時(shí)應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個(gè)液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀SDS蛋白質(zhì)膜復(fù)合物。）用合適轉(zhuǎn)頭于4以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液與細(xì)菌裂解物混合不充分步驟）。）上清過(guò)濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。）用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。

20、如于4離心，鹽也會(huì)了生沉淀。）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。10）純化。四、質(zhì)粒的純化聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)（一）聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒）將核酸溶液所得轉(zhuǎn)入15mlorex 管中， 再加3ml 用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于下以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。）將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖）于室溫以10 000轉(zhuǎn)/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。）用500l含無(wú)DNA酶的胰RNA酶(20g/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。）加500l含13