高產(chǎn)油脂紅酵母的選育及培養(yǎng)條件優(yōu)化

1、生物工程食品科學(xué)2011, Vol. 32, No. 11209高產(chǎn)油脂紅酵母的選育及培養(yǎng)條件優(yōu)化徐振杰，胡容，李 珍，程子彰，黃乾明*(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安625014)摘要：以本實(shí)驗(yàn)室早期從自然界中分離純化所得 18 株高產(chǎn)類胡蘿卜素紅酵母菌株為材料，采用蘇丹黑染色法初篩、搖瓶法復(fù)篩，得到 1 株脂含量相對較高(14.63%)的菌株 SCAU-13；經(jīng)鑒定，該菌株為禾本紅酵母(Rhodotorulagraminis)；以 SCAU-13 為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變、硫酸二乙酯誘變和紫外 - 硫酸二乙酯復(fù)合誘變，最終得到突變菌株 M124，其脂含量達(dá) 42.42%，為出發(fā)菌株

2、的 2.90 倍；培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果表明其最佳產(chǎn)脂條件為：以葡萄糖為碳源，(NH4)2 SO4 為氮源，碳氮比為 60:1，起始 pH6 .0，蛋白胨 1.8g/L，酵母粉 4g/L，MgSO4 7H 2O 0.5g/L，在此條件下，菌體生物量為(13.55 0.10)g/L，脂含量為(53.67 0.17)%，產(chǎn)脂量為(7.27 0.03)g/L。關(guān)鍵詞：紅酵母；微生物油脂；鑒定；誘變；培養(yǎng)條件優(yōu)化Screening of Lipid-producing Rhodotorula and Optimization of Its Fermentation ConditionsXU Zhen-jie

3、，HU Rong，LI Zhen，CHENG Zi-zhang，HUANG Qian-ming*(College of Biology and Science, Sichuan Agricultural University, Yaan625014, China)Abstract：Eighteen Rhodotorula strains (SCAU 1 through 18) that can produce carotenoids were isolated from natural environment and subjected to preliminary screening wit

4、h Sudan Black dye and further screening by shake-flask culture. As a result, strain SCAU-13 was found to have the highest lipid content of 14.63% and identified as Rhodotorula graminis. The strain was mutagenized respectively with UV light, diethyl sulfate (DES) and their combination, resulting in 1

5、3 mutants, and strain M124 containing the largest amount of lipids among the 13 mutants was screened out, which was 42.42% and 2.90 times as high as that of the original strain SCAU-13. Orthogonal array optimization showed that the optimal fermentation conditions for lipid production by strain M124

6、were glucose as carbon source, (NH4)2SO4 as nitrogen source, carbon-to-nitrogen ratio of 60:1, initial pH 6.0, peptone concentration of 1.8 g/L, yeast extract concentration of 4 g/L and MgSO47H2O concentration of 0.5 g/L. Under the optimal culture conditions, the cellular biomass and the lipid conte

7、nt of dry bacterial cells were (53.67 0.17) % and (13.55 0.10) g/L, respectively, and the yield of lipid (7.27 0.03) g/L fermentation broth. Key words：Rhodotorula；microbial oil；identification；mutation；culture optimization中圖分類號：Q819文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1002-6630(2011)11-0209-07微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂(single cell oils，SC

8、O)，是指由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚矗诰w內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂 1 。早期的微生物油脂研究主要集中在 - 亞麻酸(GLA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等功能性油脂的開發(fā)上。近年來，由于能源問題的日益突出，生物柴油應(yīng)運(yùn)而生，目前多采用動植物油脂生產(chǎn)生物柴油，但原料成本偏高，經(jīng)濟(jì)可行性差。產(chǎn)油微生物具有資源豐富、油脂含量高、碳源利用譜廣等特點(diǎn)，開發(fā)潛收稿日期：2010-09-30力大，利用微生物生產(chǎn)油脂成為開發(fā)油脂資源的一個(gè)新方向 2 。目前，研究較多的是酵母、霉菌和微藻 3 - 6 。但是，

9、國內(nèi)目前還沒有能夠用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)油脂的優(yōu)良菌株。紅酵母是一類單細(xì)胞真菌，不僅可以積累大量油脂、產(chǎn)生類胡蘿卜素、合成并分泌過氧化物歧化酶 ( S O D ) ，其菌體還是優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞蛋白；在一定條件下，還能產(chǎn)丙氨酸、蛋氨酸和谷氨酸 7 ；其營養(yǎng)要求簡單、粗放，可用蔗渣、廢糖蜜等作為培養(yǎng)基質(zhì)，成本較低。紅酵母自身的這些特性使得它具有巨大的潛在基金項(xiàng)目：四川省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(08ZA053)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(00731200)作者簡介：徐振杰(1986 )，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锷锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E -mail：xzj5845126 .com* 通信作者：黃乾明

10、(1964 )，男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锷锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail： .cn2102011, Vol. 32, No. 11食品科學(xué)生物工程應(yīng)用價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景。本研究從實(shí)驗(yàn)室已有的 18 株高產(chǎn)類胡蘿卜素的紅酵母中篩選到 1 株油脂產(chǎn)量較高的菌株，并通過誘變和培養(yǎng)條件優(yōu)化，進(jìn)一步提高了油脂產(chǎn)量，為該紅酵母菌株的綜合利用提供參考，也為發(fā)掘新的油脂微生物資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1試劑與儀器葡萄糖、酵母膏、蛋白胨為生物試劑；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。SHZ-82 水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市進(jìn)程國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；GHP-9050 隔水式恒溫培

11、養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；KYKY-1000B 型掃描電子顯微鏡 美國Amray 公司；MyCycler PCR 儀美國 Bio-Rad 公司；凝膠電泳系統(tǒng)北京六一儀器廠。1.2菌株與培養(yǎng)基紅酵母菌株 SCAU-1、SCAU-2、SCAU-3、SCAU-4、SCAU-5、SCAU -6、SCAU-7、SCAU -8、SCAU-9、SCAU-10、SCAU-11、SCAU-12、SCAU-13、SCAU-14、SCAU-15、SCAU-16、SCAU-17 和 SCAU-18，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、保存。固體培養(yǎng)基( g / L)：葡萄糖 3 0 、蛋白胨 2 0 、酵母粉

12、20 、瓊脂 20 ，pH 值自然。種子培養(yǎng)液(g/L)：葡萄糖 50 、蛋白胨 20 、酵母粉 20 、M g SO 4 7H 2 O 0 . 5 ，pH 值自然。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 120、酵母粉 4、KNO3 9、NH4H2PO4 3、(NH4)2SO4 6、蛋白胨 1.8、M gSO 4 7H2 O0. 5 ，pH 值自然。1.3方法1.3.1初篩采用蘇丹黑定性染色法 8 。1.3.2復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)法。 培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基， 500mL 三角瓶中裝樣 80mL，按體積分?jǐn)?shù) 5% 接種，28、 176r/min 搖床培養(yǎng) 144h，離心，收集菌體，分別測定其菌體生物量

13、、脂含量及產(chǎn)脂量。菌體生物量的測定采用菌體干質(zhì)量法9；油脂的提取采用酸熱 - 有機(jī)溶劑萃取法 1 0 。菌體干質(zhì)量/g菌體生物量 /(g/L)= 發(fā)酵液體積/L油脂質(zhì)量脂含量 /%= 100 菌體干質(zhì)量產(chǎn)脂量 /(g/L)= 脂含量生物量1.3.3菌株的鑒定形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定：參照微生物分類學(xué)1 1 及酵母菌的特征與鑒定手冊1 2 。18S rDNA 分子生物學(xué)鑒定：參照文獻(xiàn)13方法提取基因組 DNA。18S rDNA PCR 擴(kuò)增引物：上游引物：5-TAGTCATATGCTTGTCTCAAAGA-3，下游引物：5-AACCTTGTTACGACTTTTACTTC-3，由上海英駿(Invi

14、trogen)生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系(25L)：上下游引物各 1L、模板 DNA 1L、10 PCR Buffer2.5L，dNTP (2.5mmol/L each) 2L，MgCl2(25mmol/L)2L，Taq 酶 0.5L，補(bǔ)充超純水至 25L。PCR 擴(kuò)增程序：94預(yù)變性 3min；94 1min，48 1min，723min，循環(huán) 30 次；72延伸 10min。將 PCR 產(chǎn)物回收，與 pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5后，送北京華大基因研究中心測序。采用 MEGAV4.0 軟件中的鄰位加入法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹14。1.

15、3.4誘變及正向突變菌株的篩選紫外(UV)誘變：取 15mL 菌懸液于 90mm 無菌培養(yǎng)皿中，置于已穩(wěn)定發(fā)光 30min 的 15W 醫(yī)用紫外燈下 20cm 處，磁力攪拌下，通過控制照射時(shí)間來控制誘變劑量。此操作在紅光或黑暗中進(jìn)行，以防光復(fù)活。硫酸二乙酯(DES)誘變：取 15mL 菌懸液于無菌錐形瓶，加入 D E S 溶液，使其最終體積分?jǐn)?shù)為 2 % ，放入30、150r/min 水浴搖床，通過控制時(shí)間來控制誘變劑量。時(shí)間結(jié)束后，立即加入 2.5 倍體積的 25g/100mL 硫代硫酸鈉溶液，終止反應(yīng)。對照組活菌數(shù)處理后活菌數(shù)致死率 /%= 100 對照組活菌數(shù)UV-DES 復(fù)合誘變：經(jīng)過

16、 DES 處理的菌懸液，再進(jìn)行 U V 誘變。正向突變菌株的篩選：從突變菌株中挑取生長良好的單菌落，通過初篩和復(fù)篩得到目的菌株。1.3.5培養(yǎng)條件的優(yōu)化先采用單因素試驗(yàn)法考察不同碳源、氮源、碳氮比(C/N)和初始 pH 值對菌株產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響，然后采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)見表 1 。表 1正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design水平因素A 碳源B 氮源C 碳氮比D pH1葡萄糖NaNO320:15.02果糖NH4NO340:16.03蔗糖(NH4)2SO460:17.0生物工程食品科學(xué)2011, Vol

17、. 32, No. 112111.3.6數(shù)據(jù)分析及處理數(shù)據(jù)分析采用軟件 Origin7.0 和 SPSS 13.0，結(jié)果表示為平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤，方差分析采用 Duncans 法檢驗(yàn)，進(jìn)行顯著性分析。2 結(jié)果與分析2.1原始菌株的初篩蘇丹黑染色法是檢測脂肪的經(jīng)典方法，能將大部分非優(yōu)良菌株排除掉，有效地提高篩選效率。1 8 株產(chǎn)類胡蘿卜素紅酵母菌株經(jīng)蘇丹黑染色法染色后，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢，結(jié)果見表 2 。表 218 株紅酵母的鏡檢初篩結(jié)果Table 2Primary screening of 18 Rhodotorula strains菌株號染色結(jié)果菌株號染色結(jié)果SCAU-1+ + +SCAU-10+

18、 +SCAU-2+ + +SCAU-11+ + +SCAU-3+ +SCAU-12+ + + + +SCAU-4+SCAU-13+ + + + +SCAU-5+ + +SCAU-14+ + + + +SCAU-6+ + +SCAU-15+ + + + +SCAU-7SCAU-16+ +SCAU-8SCAU-17+ + + +SCAU-9+ + +SCAU-18+ + + +注：+ . 染色程度；. 幾乎沒有脂肪粒著色。從表 2 可以看出，僅菌株 SCAU-7 和 SCAU-8 未見藍(lán)黑色脂肪顆粒，其余菌株均可見藍(lán)黑色脂肪顆粒。依據(jù)染色程度初步判斷菌株的脂含量，選取 S C A U - 12 、

19、SCAU-13、SCAU-14、SCAU-15、SCAU-17 和 SCAU-18 六個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)篩。2.2原始菌株的復(fù)篩表 3 紅酵母菌株的復(fù)篩結(jié)果(n=3) Table 3 Secondary screening of 6 preliminarily screened Rhodotorula strains (n=3)菌株號菌體生物量 /(g/L)脂含量 /%產(chǎn)脂量 /(g/L)SCAU-129.77 0.15e7.89 0.15d0.77 0.01dSCAU-1311.63 0.17c14.63 0.11a1.70 0.02aSCAU-1410.62 0.15d10.07 0.09b1.

20、07 0.02bSCAU-159.46 0.18e10.38 0.17b0.98 0.01cSCAU-1714.06 0.21a3.44 0.18e0.48 0.02eSCAU-1813.28 0.15b8.35 0.13c1.11 0.02b注：同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示差異顯著( P 0 . 0 5 ) 。下同。采用搖瓶培養(yǎng)法對初篩所得 6 株菌株進(jìn)行復(fù)篩，分別測定其生物量、脂含量和產(chǎn)脂率，結(jié)果如表 3 所示，菌株 SCAU-13 的脂含量和產(chǎn)脂率最高，其生物量僅低于菌株 SCAU-17 和 SCAU-18，由于產(chǎn)脂率可以作為油脂產(chǎn)量的一個(gè)綜合指標(biāo)，故選擇菌株 SCAU-13 作為下一步實(shí)驗(yàn)

21、用菌株。2.3菌株 SCAU-13 的鑒定2.3.1形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定10m 5000#0020KVAMRAV圖 1 菌株 SCAU-13 掃描電鏡照片( 5000)Fig.1Scanning electron micrograph of the strain SCAU-13( 5000)菌株 SCAU-13 在固體培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，較濕潤，表面光滑，邊緣無缺刻，有明顯的紅色；掃描電鏡觀察結(jié)果(圖 1)表明，其細(xì)胞呈圓形或橢圓形，芽殖；細(xì)胞長約 4 6m ，寬約 3 5m ；有成簇、成鏈現(xiàn)象。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株不能發(fā)酵糖類產(chǎn)生 CO2 ；同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 4 所示。根據(jù)菌株的形態(tài)及生

22、理生化特征初步鑒定 S C A U - 13 為禾本紅酵母( R ho d ot o r ul agraminis )。表 4 菌株 SCAU-13 同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4Assimilation tests of the strain SCAU-13項(xiàng)目結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果D- 木糖生長+無生長素生長+麥芽糖生長+無對氨基苯甲酸鹽生長+乳糖生長于 25生長+松三糖生長于 30生長+D- 甘露醇生長+于 37生長硝酸鹽生長+0.1g/100mL 放線菌酮生長+乙胺生長+淀粉形成尸胺生長+擲孢子形成注：+ . 呈陽性；. 呈陰性 。2.3.218S rDNA 分子生物學(xué)鑒定1M2000bp1000b

23、p750bp500bp250bp100bp1. PCR 產(chǎn)物；M. DL2000 DNA Marker。圖 2 SCAU-13 的 18S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2Electrophoresis of 18S rDNA PCR products for the strain SCAU-132122011, Vol. 32, No. 11食品科學(xué)生物工程以菌株 SCA U- 13 基因組 DN A 為模板，采用 18SrDNA 引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。其擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖 2 所示。產(chǎn)物經(jīng)純化、測序得到 1846bp DNA 片段序列，該序列已登錄 GenBank(登錄號：H

24、M371376)，具有 18S rDNA 的典型特征。在 NCBI 中進(jìn)行 Blast 同源性檢索，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹( 圖 3) ，結(jié)果顯示 SC A U - 13 與Rhodotorula graminis (X83827)聚為一簇，與形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定結(jié)果一致。因此將菌株 SCAU-13 鑒定為禾本紅酵母(R.graminis)。100/%8060致死率40200204060801000時(shí)間 /min圖 5致死率和 DES 誘變劑量的關(guān)系Fig.5Relationship between lethal rate and DES dose99%78%98%90%76%83%Rhodotoru

25、la glutinis(X69853)Rhodotorula graminis(X83827)SCAU-13(HM371376)Rhodotorula glutinis(AB016291)Rhodotorula glutinis(AB016293)Rhodotorula glutinis(AB016292)Rhodosporidium babjevae (AB073270)2.5誘變菌株的篩選及其遺傳穩(wěn)定性考察經(jīng) UV 誘變、DES 誘變以及 UV-DES 復(fù)合誘變，從生長良好的突變菌株中初篩得到 13 個(gè)菌株，其復(fù)篩結(jié)果(表 5)表明，菌株 M124 的脂含量最高達(dá)(42.42 0.15)%

26、，75%80%72%Rhodosporidium diobovatum (AB073271)Rhodotorula graminis (EU563924)Rhodotorula glutinis (AB018402)Rhodotorula glutinis (DQ832194)Rhodotorula glutinis (AB018403)為出發(fā)菌株 SCAU-13 的 2.90 倍，故確定其為最終的目標(biāo)菌 株 。表 5 SCAU-13 突變菌株的復(fù)篩結(jié)果(n=3)圖 3基于 18S rDNA 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3Phylogenetic tree based on 18S rDNA

27、sequences2.4誘變劑量的選擇10080/%60致死率402000306090120150180時(shí)間 /s圖 4致死率和 UV 誘變劑量的關(guān)系Fig.4Relationship between lethal rate and UV radiation dose紫外誘變的平均致死率測定結(jié)果如圖 4 所示，一經(jīng)紫外照射，菌株 SCAU-13 細(xì)胞就開始死亡，并隨著照射時(shí)間的延長致死率逐漸增高，照射時(shí)間為 100s 時(shí)，細(xì)胞死亡率達(dá)(97.17 0.05)%。為了獲得較高的正向突變率，控制致死率為 8 0% 9 0% ，選擇紫外照射時(shí)間為 80s 。D ES 誘變的平均致死率測定結(jié)果見圖 5

28、 ，誘變時(shí)間從 40min 到 60min 的過程中，致死率迅速上升，但是此后隨著誘變時(shí)間的延長，致死率并無顯著變化，保持在 8 0% 左右。為了獲得較高的正向突變率，控制其致死率為 70%80%，選擇誘變時(shí)間為 70min，DES 體積分?jǐn)?shù)為 2 % 。Table 5Secondary screening of SCAU-13 mutant strains (n=3)誘變菌株菌體生物量 /(g/L)脂含量 /%產(chǎn)脂量 /(g/L)UM058.60 0.46e6.64 0.31h0.57 0.04hM1911.21 0.27bcd26.77 0.42e3.00 0.04defUM238.20

29、0.45e24.55 0.41g2.01 0.13gUM3310.25 0.09d30.88 0.32c3.17 0.05cdUM368.43 0.69e26.46 1.35ef2.23 0.29gUM6410.94 0.32b25.45 0.75fg2.78 0.04fM4812.98 0.38a35.09 0.14b4.56 0.15bM504.10 0.82f3.29 0.74i0.14 0.01iM12211.11 0.35b26.03 0.29ef2.89 0.06efM12311.40 0.40bc29.86 0.30c3.41 0.15cM12411.80 0.13b42.42

30、0.15a5.01 0.04aDM12511.06 0.33bcd28.55 0.26d3.16 0.08cdeDM1310.68 0.33cd28.57 0.35d3.05 0.06def表 6 菌株 M124 的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Genetic stability of the strain M124傳代次數(shù)菌體生物量 /(g/L)脂含量 /%產(chǎn)脂量 /(g/L)011.80 0.1442.42 0.105.01 0.01212.11 0.0940.92 0.174.96 0.01411.72 0.1341.38 0.154.85 0.02611.35 0.1542.64

31、0.184.84 0.02812.06 0.0842.20 0.115.09 0.011011.99 0.0640.69 0.094.88 0.01平均值11.84 0.1741.71 0.204.94 0.02t 檢驗(yàn)0.332.291.79注：t 0 . 0 5 = 2 . 5 7 1 。為了考察菌株 M124 產(chǎn)脂的遺傳穩(wěn)定性，將其連續(xù)傳代 1 0 次，取第 0 、2 、4 、6 、8 、 1 0 代搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng) t 檢驗(yàn)，結(jié)果( 表 6) 顯示各代之間生物量、脂生物工程食品科學(xué)2011, Vol. 32, No. 11213含量和產(chǎn)脂量差異不顯著(P 0.05)，即菌株 M124

32、遺傳性狀穩(wěn)定。2.6菌株 M124 的發(fā)酵條件優(yōu)化2.6.1碳源對菌株 M124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響分別選用葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖作為單一碳源，其他條件不變，考察碳源對菌株 M124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響 。結(jié)果如圖 6 所示，葡萄糖、果糖、蔗糖均為相對較好的碳源，其中果糖更有利于油脂的積累，蔗糖更有利于菌體的生長，而以葡萄糖為碳源時(shí)，產(chǎn)脂率最高，達(dá)(5.27 0.02)g/L。而麥芽糖既不利于菌體的生長，也不利于油脂的積累，這與文獻(xiàn)報(bào)道 1 5 的紅酵母(Rhodotorula grutinis)利用麥芽糖的能力較強(qiáng)的有所不同，這種差異是由菌株自身的遺傳因素決定的。16生物量產(chǎn)脂量脂含量50/

33、(g/L)生物量/(g/L)產(chǎn)脂量1240/%脂含量8302041000葡萄糖果糖D- 麥芽糖蔗糖碳源圖 6碳源對菌株 M 1 2 4 的發(fā)酵培養(yǎng)的影響Fig.6Effect of carbon source on fermentation efficiency of the strainM1242.6.2氮源對菌株 M124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響20生物量產(chǎn)脂量脂含量50/(g/L)生物量/(g/L)產(chǎn)脂量1540/%脂含量10302051000素NO3粉)2SO4NaNO3胨尿母白NH4酵(NH4蛋氮源圖 7氮源對菌株 M124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響Fig.7 Effect of nitrogen

34、 source on fermentation efficiency of the strain M124分別選用尿素、蛋白胨、N a N O 3 、(NH4 ) 2SO 4 、酵母粉和 NH4 NO3 作為單一氮源，其他條件不變，考察氮源對菌株 M 124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響。結(jié)果如圖 7 所示，以蛋白胨為氮源時(shí)菌體生物量最大達(dá)(15.37 0.43)g/L；以(NH4 )2 SO4 為氮源時(shí)脂含量和產(chǎn)脂量都達(dá)到最高，分別為(46.10 0. 08)%、(5. 94 0.02)g/L。以 NaN O3、 NH4 NO3 、(NH4 )2SO4 為氮源時(shí)的脂含量高于以尿素、酵母粉、蛋白胨為氮源時(shí)

35、的脂含量，這與 R atledge 等 1 6 的報(bào)道一致，即無機(jī)氮源更有利于油脂的積累。菌株M124 在以尿素為氮源時(shí)，雖然生物量很低，但是脂含量仍屬較高，在大規(guī)模發(fā)酵的后期可以采用廉價(jià)的尿素作為替代氮源，以節(jié)約成本。2.6.3碳氮比對菌株 M124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響16生物量產(chǎn)脂量脂含量60/(g/L)生物量/(g/L)產(chǎn)脂量1250/%脂含量2048403001020:130:140:150:160:110:1碳氮比圖 8碳氮比對菌株 M124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響Fig.8Effect of carbon-to-nitrogen ratio on fermentation efficien

36、cy ofthe strain M124在固定葡萄糖用量的情況下，分別設(shè)計(jì)碳氮比為10:1、20:1、40:1、60:1，探討碳氮比對菌株 M124 產(chǎn)油脂發(fā)酵的影響。結(jié)果如圖 8 所示，隨著碳氮比的增大，脂含量大幅上升，并在碳氮比為 40: 1 時(shí)達(dá)到最大值(51.65 0. 09)% ，隨后有下降趨勢；生物量則先增加，隨后逐漸減小。這是由于在培養(yǎng)基中氮源耗盡、碳源充足的情況下，菌體的油脂積累才開始 17-19 ，而氮源過少則會影響到菌體的生長。碳氮比為 40: 1 時(shí)，菌株 M124 的產(chǎn)脂量達(dá)到最大值(6.06 0.09)g/L。2.6.4初始 pH 值對菌株 M124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

37、16生物量產(chǎn)脂量脂含量451240/(g/L)生物量/(g/L)產(chǎn)脂量35/%脂含量20483025150106785pH圖 9pH 值對菌株 M124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響Fig.9Effect of pH on fermentation efficiency of the strain M124為了考察初始 pH 值對菌株 M124 產(chǎn)油發(fā)酵的影響，分別調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始 pH 值為 5.0、6.0、7.0、8.0。結(jié)果如圖 9 所示，菌體生長的最適 pH 值為 5.06.0，2142011, Vol. 32, No. 11食品科學(xué)生物工程油脂積累的最適 pH 值為 6.07.0。在 p

38、H6.0 時(shí)，菌體生物量、脂含量和產(chǎn)脂量都達(dá)到最大，分別為(12.62 0.11)g/L、(41.11 0.04)% 和(5.19 0.01)g/L。文獻(xiàn)19-20報(bào)道酵母菌油脂積累的最適初始 pH 值接近中性，而本研究中菌株 M124 油脂積累的最適初始 pH 值偏酸性，這可能是由于該菌株在發(fā)酵過程中不產(chǎn)酸，從而使得發(fā)酵前后培養(yǎng)基的 pH 值變化不大。而對于一些產(chǎn)酸的油脂微生物，則需將初始 pH 值調(diào)節(jié)至中性甚至偏堿性，以抵消菌體發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸，使得培養(yǎng)基的 pH 值不至于過低。2.6.5正交試驗(yàn)表 7 L9 (34 )正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果分析 Table 7 Orthogonal a

39、rray design matrix, corresponding experimental results and range analysis試驗(yàn)號因素菌體生物脂含量 /%產(chǎn)脂量 /ABCD量 /(g/L)(g/L)1111114.1430.084.252122212.3139.604.873133313.7245.586.254212312.0638.124.605223110.5439.434.156231213.3731.084.167313213.1942.965.678321311.0731.563.499332110.6839.564.22k113.3913.1312.8611

40、.79k211.9911.3111.6812.96最優(yōu)組合：A1 B 1 C 1 D 2k311.6512.5912.4812.28R1.741.821.181.17k138.4237.0530.9136.36k236.2136.8639.0937.88最優(yōu)組合：A1 B 3 C 3 D 3k338.0338.7442.6638.42R2.211.8811.752.06k15.124.843.974.21k24.304.174.564.90最優(yōu)組合：A1 B 3 C 3 D 2k34.464.885.364.78R0.820.711.390.69從表 7 可以看出，各因素對菌株 M124 的生

41、物量、脂含量和產(chǎn)脂量的影響不盡一致。影響菌體生物量的因素主次順序?yàn)椋旱刺荚刺嫉?pH 值；對于脂含量：碳氮比碳源 pH 值氮源；對于產(chǎn)脂量：碳氮比碳源氮源 pH 值。由于產(chǎn)脂量是菌株產(chǎn)脂能力的最終考察指標(biāo)，故選擇菌株 M124 發(fā)酵產(chǎn)油脂的最優(yōu)條件組合為：以葡萄糖為碳源、(N H 4 ) 2 S O 4 為氮源、碳氮比為 60:1、初始 pH6.0、蛋白胨 1.8g/L、酵母粉 4g/L、 MgSO47H2O 0.5g/L。在此發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，菌株 M124 的生物量、脂含量和產(chǎn)脂量分別達(dá)到了(13.55 0.10)g/L、(53.67 0.17)%、(7.27 0.03

42、)g/L，比優(yōu)化前分別提高了 14.83%、26.52%、45.11%，其中，產(chǎn)脂量高于表 7 中所有實(shí)驗(yàn)組，達(dá)到最高值。其脂含量比相關(guān)報(bào)道的黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)的脂含量43.6%15和深黃被孢霉(Mortierella isabellina)的脂含量4 5 . 7 % 4 分別高出 1 0 % 和 8 % ，與子囊菌油脂酵母(Lipomyces tetrasporus)20和斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)21的脂含量基本持平，與目前報(bào)道的脂含量最高(76.1%)的圓紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides) 相比

43、還有一定的差距3。這說明 R. graminis M 124 的脂含量仍屬較高水平，也是具有開發(fā)前景的油脂產(chǎn)生菌 株 。由于產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)通常采用碳氮比很高的培養(yǎng)基，有利于油脂的積累但是不利于生物量的積累，脂含量較高時(shí)往往生物量較低，從而導(dǎo)致單位體積發(fā)酵液的脂含量難以大幅提高，這種高脂含量與高生物量不統(tǒng)一是微生物油脂生產(chǎn)中經(jīng)常遇到的問題，如 Fakas 等22在研究 Cunninghamella echinulata 對木糖的利用效率時(shí)發(fā)現(xiàn)，其菌體脂含量可達(dá) 57.7%，而其生物量僅為 11.6g/L；劉淑君等21對斯達(dá)氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化

44、，得到了脂含量高達(dá) 53.6% 的菌體，而其生物量僅為 11.0g/L。本研究中 R. graminis M124 脂含量達(dá) 53.67% 時(shí)，但在此培養(yǎng)條件下生物量僅為 13.55g/L，導(dǎo)致產(chǎn)脂率較低。通過進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件與改變培養(yǎng)方式有望實(shí)現(xiàn)高脂含量與高生物量的統(tǒng)一，如張杰等9研究發(fā)現(xiàn)采用分批補(bǔ)料的培養(yǎng)方式可以使隱球酵母(Cryptococcus curvatus O3)在脂含量達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量 65.1%的情況下生物量達(dá)到 51.8g/L。如何在保持高脂含量的前提下大幅提高其生物量將是后續(xù)研究中亟待解決的關(guān)鍵問 題 。3結(jié)論誘變選育得到 1 株高產(chǎn)油脂紅酵母菌株 M124，鑒定為禾本紅酵母(R.graminis)，目前尚未見其產(chǎn)油脂方面的研究報(bào)道。菌株 M124 產(chǎn)油脂能力較強(qiáng)，生長性能良好，是一株具有開發(fā)前景的優(yōu)良高產(chǎn)油脂菌株。其最優(yōu)培養(yǎng)條件為：葡萄糖為碳源、(N H4 ) 2 S O 4 為氮源、碳氮比為 60:1、起始 pH6.0、蛋白胨 1.8g/L、酵母粉 4g/L、MgSO47H2O 0.5g/L，500mL 錐形瓶中裝培養(yǎng)基 80mL，按體積分?jǐn)?shù) 5% 接種，28、176r/min 搖床培養(yǎng) 144h，其生物量、脂含量和產(chǎn)脂量分別達(dá)到了(13.55 0.10)g/L、 (53.67 0.17)%、(7.27 0.03)g