毛細管電泳儀應用於中藥成分之分析定量

1、毛細管電泳儀應用於中藥成分之分析定量行政院衛(wèi)生署 藥物食品檢驗局 顧祐瑞博士、/一前言中藥為我國重要的文化資產(chǎn)之一， 原本就值得推廣與重視， 近年來國內(nèi)許多大企業(yè)投入大筆經(jīng)費，致力於中藥新藥之研發(fā)。由於中藥材之成分複雜，且常因基原、產(chǎn)地、採收季節(jié)、炮製、儲存等種種因素，致使其成分有相當大的差異，進而影響中藥材的品質(zhì)。 因此， 有關(guān)中藥成分之分析及品質(zhì)之管制，變得相當?shù)闹匾?行政院衛(wèi)生署為了提昇中藥濃縮製劑的品質(zhì)， 月一日起， 凡申請葛根湯等十種中藥方劑之濃縮製劑， 時，應制訂指標成分定量方法。美國藥物食品管理局 for Industry (Draft) Botanical Drug Prod

2、ucts 中草藥新藥研發(fā)，需以 CMC ( 即化學、製造、品質(zhì) 已於八十九年七月二十四日公告， 自九十年一 查驗登記新案及藥品許可證有效期間展延(FDA) 亦於八十九年八月公佈， Guidance(美國FDA植物性藥物產(chǎn)品規(guī)範草案)，提岀) 加以管制。目前中藥成分之分析定量，以高效液相層析(HPLC)最普遍，然而HPLC分析時存在著若干變數(shù)及困難，例如通常分析時間長，且分析完成後管柱之清洗時間亦甚長；更換溶媒、管柱，清洗管柱需要時間，致使儀器自動化限制多；成分易殘留於管柱內(nèi)，清洗不易，使用之緩衝溶液等添加劑， 則易損害管柱內(nèi)之填充物； 管柱及溶劑費用高， 尤其會產(chǎn)生大量含有有毒溶劑 ( 如乙月

3、青、 二氯甲烷 ) 之廢液。毛細管電泳 (Capillary electrophoresis或 High performance capillaryelectrophoresis) ，簡稱CE或HPCE是最近十年來蓬勃發(fā)展的分析方法，電泳是電介質(zhì)中帶電粒子在電場作用下， 以不同速度向電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象， 利用這種現(xiàn)象對某些化學成分進行分析的技術(shù)。毛細管電泳的發(fā)展，在1967年Hjerten等率先提岀在高電場，直徑3mm毛細管中作自由溶液的毛細管區(qū)帶電泳 (Capillary zone electrophoresis)，簡稱為 CZE；1984 年 Terabe 等建立一種重要的分離模

4、式，即以各組成分 (特別是中性成分 )，在毛細管內(nèi)的膠束 (Micelle) 及緩衝溶 液之間的分配為基礎之膠束電動力學毛細管層析 (Micellar electrokinetic capillarychromatography)，簡稱為 MECC或MEKC 1990年Honda等最早將毛細管電泳應用於芍藥中Paeoniflorin及Oxypaeoniflorin之定量，發(fā)現(xiàn)毛細管電泳之再現(xiàn)性佳，定量結(jié)果與HPLC相似。毛細管電泳的種種方法中以上述CZE及MEKCt常用，其中 CZE是毛細管電泳中最簡單的一 種方法，毛細管內(nèi)只充入緩衝溶液，分析之成分以不同的速率在分立的區(qū)帶內(nèi)進行遷移，正、ME

5、KC是毛細管電泳中應用最廣的方離子化合物即可分離，而中性化合物在電場中則不會移動。法之一，既能分離中性成分，也能分離帶電成分，MEKC主要是在緩衝溶液中，加入一定濃度以上的界面活性劑，以形成膠束，其應用範圍包括維生素、大部分藥物及中藥成分。本文所舉之天 麻及玄參兩個例子，皆為 MEKC方法，且均以膽酸鈉作為界面活性劑，分析二種藥材中之不帶電 荷高極性成分。毛細管電泳之分析方法，係利用不同樣品離子電荷泳動速度的差異，配合毛細管內(nèi)電解質(zhì)在外加高電場下所產(chǎn)生的電滲流，形成各種樣品離子在毛細管中淨移動速度不同，因而達到分離效果。與傳統(tǒng)的平板電泳或高效液相層析比較，毛細管電泳的分離效率極高，理論板數(shù)常在

6、105107左右。另外，毛細管口徑小，散熱效果佳，因此可使用高電場進行電泳，大幅縮短樣品分離時 間。毛細管電泳與高效液相層析皆屬液相分離技術(shù)，兩者之分離機制不同，各有其應用的價值，惟就分離效率、分析速度、成本花費及樣品用量而言，毛細管電泳之理論板數(shù)較高，分析速度 更快，幾乎不消耗溶劑，而樣品用量僅高效液相層析的數(shù)百分之一。毛細管電泳只要針對不同 的分子性質(zhì)（如分子大小、電荷數(shù)、疏水性等）改變操作模式和緩衝溶液的成分，便可分離不同的樣品。相較之下毛細管電泳具有更大的選擇性，欲分析不同的樣品亦不需更換價格昂貴的管 柱。毛細管電泳與高效液相層析之比較整理如下：毛細管電泳高效液相層析分析速度較快較慢理

7、論板數(shù)較咼較低溶媒消耗無或少多樣品量低（以nl計）高（卩l(xiāng)計）管柱價格低高管柱清洗快、容易費時自動化高不容易二？毛細管電泳應用(一)麻藥材中 Parishin 、Parishin B 及 Parishin C之含量測定：天麻，原名赤箭，別名明天麻，係蘭科(Orchidaceae)植物天麻 Gastrodia elata 的乾燥根莖。Parish in (tris4-( p -D-glucopyra no syloxy)ben zyl citrate) 、 Parish in B 及 Parish in為自天麻分離得到之三種C(1,2-及 1,3-bis 4-( p -D-glucopyrano

8、syloxy) benzyl citrate)筆者建立了三種成分之毛細管電泳與高高極性成分，分別為帶有三個及二個葡萄糖之檸檬酸鹽, 效液相層析之分析方法，其條件如下：1.高效液相層析之條件：高效液相層析儀：Hitachi 廠牌 HPLC L-6200 pump 連接 Hitachi 廠牌 L-3000 Photodiode array檢測器及Shimazu廠牌SIL-9A自動注射器。分析柱：Cosmosil 5C 傳-AR, 5 卩 m,內(nèi)徑 4.6mm I.D. x 150mm。檢測波長：UV 222nm。移動相：A:甲醇。B： 0.1%磷酸溶液時間（分）AB01585152575線性梯度條

9、件303070403070流速：1.0mL/min。內(nèi)部標準品：Sulfamethoxypyridazi ne。2.毛細管電泳層析之條件：毛細管電泳儀：Beckman廠牌P/ACE 5500。毛細管： Beckman 內(nèi)徑 75mrx 67cm uncoated capillary 。檢測波長：UV 222nm。緩衝液：20mMSodium tetraborate 及 20mMSodium dihydrogenphosphate調(diào)配為 pH6.5 含 100mMSodium cholate 之溶液。溫度：30C。電壓：15KV。內(nèi)部標準品： Methylparabe n 。天麻三種成分之毛細管

10、電泳分析，緩衝液用pH6.5四硼酸鈉及磷酸二氫鈉，加入膽酸鈉作界面活性劑，其圖譜如圖一所示，可在十七分鐘內(nèi)完成，並且有很好的回收率（94.8100.5%）及相層析分析時間較長，如圖二所示，為毛細管電泳之二倍。比較二種方法之再現(xiàn)性 (如表一)，毛細管電泳無論在三次分析成分時間或含量測定之相對標準偏差，其結(jié)果均在2%以下，與高效液相層析相當。以二種方法定量分析四件市售天麻藥材，其結(jié)果相差不多(如表二所示)。表一天麻藥材中指標成分分別以高效液相層析及毛細管電泳分離之再現(xiàn)性比較指標成分高效液相層析毛細管電泳相對標準偏差(%, n=3)相對標準偏差(%, n=3)滯留時間含量測定遷移時間含量測定Pari

11、sh in1.240.481.541.18Parishin B1.140.201.312.01Parishin C1.221.751.261.59(二)玄參中 2-(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl) ethyl 1-O- a -L-arabinopyranosyl(1 f 6) -feruloy l(1 f 4) - a 丄-rhamnopyranosyl(1 f 3) - p -D-glucopyranoside(SN-A)、Harpagoside(SN-B)及 Cinnamic acid(SN-C)之含量測定：玄參，別名元參、黑參，係玄參科(Scrophulariace

12、ae) 植物玄參 Scrophularia ningpoensis 或S. buergeriana 之乾燥根。SN-A、SN-B及SN-C為自玄參分離得到之三種高極性成分，其中 SN-A為帶有阿拉伯膠糖、鼠李糖及葡萄糖之複雜化合物；SN-B為帶有一個葡萄糖之化合物；SN-C(桂皮酸)為小分子化合物，三種成分之分子量分別為784、494及148，其差異頗大，但因毛細管電泳之選擇性高，仍可在短時間內(nèi)完成分析。毛細管電泳與高效液相層析分析方法之條件 如下：1. 高效液相層析之條件：高效液相層析儀：與天麻相同。層析管：Cosmosil 5C 18-AR,5mm,內(nèi)徑 4.6mnX 150mm表二四件市

13、售天麻藥材分別以高效液相層析及毛細管電泳定量之結(jié)果毛細管電泳高效液相層析指標成分市售藥材(mg/g)(mg/g)Parishi n112.5613.51214.5515.1536.866.9946.456.42Parishin B14.834.6424.884.5333.313.0642.462.32Parishin C12.172.2522.172.0831.381.3741.251.30檢測波長：UV 278nm移動相：A:乙月青B: 1.0%醋酸溶液。時間（分）AB線性梯度條件01585442773流速：1.0mL/min。內(nèi)部標準品：Sorbic acid2. 毛細管電泳層析之條件：

14、毛細管電泳儀：與天麻相同 毛細管： Beckman 內(nèi)徑 75mrW 67cm uncoated capillary 。表三玄參藥材中指標成分分別以高效液相層析及毛細管電泳分離之再現(xiàn)性指標成分高效液相層析毛細管電泳相對標準偏差(%, n=3)相對標準偏差(%, n=3)滯留時間含量測定遷移時間含量測定SN-A0.061.000.221.11SN-B0.011.720.282.80SN-C0.041.720.211.22檢測波長：UV 280 nm緩衝液：20mMSodium tetraborate 及 20mMSodium dihydrogenphosphate調(diào)配為 pH7.5 含 120m

15、MSodium cholate 及 12%甲 醇之溶液。溫度：25C 電壓：25kV。內(nèi)部標準品：Propylparabe n 。玄參三種成分之毛細管電泳分析，緩衝液用PH7.5四硼酸鈉及磷酸二氫鈉，加入膽酸鈉作界面活性劑、甲醇作修飾劑，其圖譜如圖三所示，可在十九分鐘內(nèi)完成，也有很好的回收率（102.4103.5%）及再現(xiàn)性（同日內(nèi)之相對標準偏差為0.551.71% ;異日間之相對標準偏差為1.363.83%），高效液相層析分析時間較長，如圖四所示，亦為毛細管電泳之二倍。比較二種方法之再現(xiàn)性（如表三），毛細管電泳在三次分析成分時間，其結(jié)果均在0.3%以下，含量測定之相對標準偏差，其結(jié)果均在 3

16、.0%以下，與高效液相層析相當。以二種方法定量分析七件市售玄參藥材， 其結(jié)果亦相差不多（如表四所示）。三？結(jié)語毛細管電泳具有高選擇性、分析時間短、管柱清洗時間短、再現(xiàn)性佳、可自動化等特性，適合用於大量品管分析之用。由上述所舉例之二個研究觀之，毛細管電泳可用於中藥成分之分析， 其回收率及再現(xiàn)性均不亞於高效液相層析，運用毛細管電泳從事中藥成分之分析確屬可行。表四七件市售玄參藥材分別以高效液相層析及毛細管電泳定量之結(jié)果指標成分市售藥材1毛細管電泳（mg/g）1.70HPLC(mg/g)1.7922.092.0031.971.91SN-A41.121.0651.671.6360.700.6571.45

17、1.4510.450.4620.600.60SN-B31.461.4241.221.2251.441.4160.330.3470.670.7010.160.1620.320.3230.110.11SN-C40.280.2950.270.2760.070.0770.270.28圖二天麻之高效液相層析分析圖譜。1: Parishin B ；2： Parishin C ；3： Parishin 。IS :內(nèi)部標準品(Sulfamethoxypyridazine)圖一天麻之毛細管電泳分析圖譜。1: Parishin B；2： Parishin C；3： Parishin 。IS :內(nèi)部標準品(Meth

18、ylparaben)參考文獻1. Beale SC., 1998, Capillary electrophoresis.An altical Chemistry 70: 279R-300R.2. Mc Laughlin GM, Nolan JA, Li ndahl JL, Palmieri RH, An derson KW, Morris SC, MorrisonJA and Bronzert TJ., 1992, Pharmaceutical drug separationsby HPCE: Practicalguidelines.Journal of Liquid Chromatography 15: 961-1021.3. 劉英玫，許順吉,1993,毛細管電泳在中藥分析上的應用 ，藥物食品分析,4(2): 131-140.4. 顧祐瑞，劉宜祝，郝景平，溫國慶，林哲輝，黃文鴻,1995,天麻藥材中指標成分Parishin,Parishin B 及C之高效液相層析定量法之探討,藥物食品分析,3(4): 287-294.5. 林哲輝,顧祐瑞，