免疫SOP：甲肝M型抗體作業(yè)指導(dǎo)書

1、77文件編號(hào)：LABOPMY020第 頁(yè)，共 頁(yè) 版本：A/0生效日期：2008-02-01XXXXXX 醫(yī)院檢驗(yàn)科免疫室分析項(xiàng)目作業(yè)指導(dǎo)書 Elecsys E 170/E 411乙甲肝M型抗體1. 分析原理-捕捉法：反應(yīng)時(shí)間：18分鐘. 第一步孵育：自動(dòng)吸取10 l經(jīng)過(guò)通用稀釋液作1:400稀釋的樣本，用抗-Fd試劑遮蔽用釕復(fù)合物標(biāo)記的單克隆Anti-HAV中的IgG進(jìn)行前處理。 第二步孵育：加入生物素標(biāo)記的單克隆人IgM特異抗體、HAV抗原、鏈霉親和素包被的磁珠后，樣本中的Anti-HAV-IgM與HAV抗原和釕標(biāo)記的Anti-HAV抗體形成雙抗體夾心復(fù)合物，通過(guò)鏈霉親和素與生物素的特異結(jié)

2、合使復(fù)合物結(jié)合在固相載體上。 反應(yīng)混和液吸到測(cè)量池中，微粒通過(guò)磁鐵吸附到電極上，未結(jié)合的物質(zhì)被清洗液（PROCELL）洗去，電極加電壓后產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過(guò)光電倍增管進(jìn)行定。 檢測(cè)結(jié)果由Elecsys軟件自動(dòng)測(cè)出，病人樣本電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)與預(yù)先用抗- HAV-IgM標(biāo)定的標(biāo)本Cutoff值的信號(hào)比較得出。2. 標(biāo)本要求標(biāo)本只有按照下列方法收集、檢測(cè)才能被接受。血清標(biāo)本采集用標(biāo)準(zhǔn)樣本試管或含分離膠的試管。血漿：肝素(Li-,Na-)、K3EDTA或枸櫞酸鈉抗凝.（標(biāo)準(zhǔn): 血清值的批內(nèi)回收率 90-110%）。標(biāo)本在28可穩(wěn)定7天，-20可穩(wěn)定6個(gè)月。標(biāo)本可凍融5次11。關(guān)于使用含分離膠試管的血清的穩(wěn)

3、定性的資料,要注意試管制造商提供的資料。凍溶樣本和含沉淀的標(biāo)本使用前需離心。不要加熱滅活標(biāo)本。標(biāo)本和質(zhì)控品禁用疊氮鈉作穩(wěn)定劑。確保病人樣本、定標(biāo)物、質(zhì)控物在測(cè)試前溫度達(dá)到20-25.因?yàn)榭赡軗]發(fā)的影響,放在分析儀上的樣本、定標(biāo)物、質(zhì)控物應(yīng)在兩小時(shí)內(nèi)測(cè)試完。3. 試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和其他所需材料采用羅氏原裝配套試劑。試劑：Elecsys Anti-HAV IgM試劑盒，貨號(hào):11820591 100人份M：鏈霉親和素包被的微粒（透明瓶蓋），1瓶，6.5ml： 鏈霉親和素包被的微粒：0.72mg/ml，生物素結(jié)合能力：470ng生物素/mg粒子。含防腐劑。R1：Ru(bpy)32+標(biāo)記的Anti

4、-HAV-Ab（灰蓋），1瓶，10ml：釕復(fù)合物標(biāo)記的單克隆抗體(鼠)：0.15g/ml,抗-人-Fd抗體(綿羊)： 0.04mg/ml，HEPES緩沖液50mmol/l，pH7.2，含防腐劑。R2：生物素化的抗-人-IgM 抗體；HAV抗原（黑蓋），1瓶，10ml：生物素化的抗-人-IgM 單克隆抗體(鼠)0.4g/l；HAV抗原（細(xì)胞培養(yǎng)）25U/ml；HEPES緩沖液50mmol/l，pH7.2，含防腐劑。 校準(zhǔn)品： Cal 1 陰性定標(biāo)液1（白蓋），2瓶，0.67ml/瓶，人血清, 抗HAV-IgM 陰性,含防腐劑。Cal 2 陽(yáng)性定標(biāo)液2（黑蓋），2瓶，0.67ml/瓶, 抗HAV-

5、IgM（人）濃度約5U/ml在人血清中, 含防腐劑。質(zhì)控品：Elecsys 抗HAV IgM質(zhì)控品1和2，每個(gè)80.67ml，貨號(hào)11876368其他所需材料： Elecsys 通用稀釋液,218ml，貨號(hào)11732277，或 Elecsys 通用稀釋液,240ml，貨號(hào)03183971 Elecsys 定標(biāo)液小瓶，256帶蓋空瓶，貨號(hào) 11776576 常用實(shí)驗(yàn)室設(shè)備 Elecsys 2010或MODULAR ANALYTICS E170Elecsys2010分析儀附件: Elecsys 系統(tǒng)緩沖液（ProCell）,6380ml，貨號(hào)11662988 Elecsys 測(cè)量池清洗液（Clea

6、nCell），6380ml，貨號(hào)11662970 Elecsys 添加劑液（SysWash），1500ml，貨號(hào)11930346 Elecsys 2010反應(yīng)杯（Assay Cup），6060， 貨號(hào)11706802 Elecsys 2010吸樣頭（Assay Tip），30120，貨號(hào)11706799MODULAR ANALYSIS E170分析儀附件: Elecsys 系統(tǒng)緩沖液（ProCell M）,12L,貨號(hào)12135019 Elecsys 測(cè)量池清洗液（CleanCell M）,12L,貨號(hào)12135027 Elecsys 系統(tǒng)緩沖液/測(cè)量池清洗液預(yù)熱杯（PC/CC-Cup）,50

7、個(gè),貨號(hào)03023141 Elecsys 清洗液（ProbeWash M），1270ml，用于最終清洗和試劑轉(zhuǎn)換清洗，貨號(hào)03005712 Elecsys 反應(yīng)杯/吸樣頭盒(AssayCups/AssayTips Combimagazine M),4884，貨號(hào)12102137 Elecsys 廢物盒(wasteliner)，貨號(hào)03023150 Elecsys 系統(tǒng)清洗液支架(SysClean Adapter M)，貨號(hào)03027651各種分析儀均適用的材料 Elecsys 系統(tǒng)清洗液（SysClean），5100ml，貨號(hào)11298500各種分析儀均適用的材料4. Elecsys 系統(tǒng)清洗

8、液（SysClean），5100ml，貨號(hào)11298500儀器和校準(zhǔn)使用儀器：瑞士羅氏診斷公司生產(chǎn)Elecsys 2010/E 170/E 411全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫自動(dòng)分析儀儀器校準(zhǔn)：Elecsys Anti-HAV IgM 以羅氏參考標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)。隨機(jī)選擇單位11。定標(biāo)頻率：每批試劑盒必須用新鮮試劑和抗HAV IgM Cal 1,Cal 2定標(biāo)一次（如：試劑包在儀器上登記后不超過(guò)24小時(shí)）。另外，以下情況需要再次定標(biāo)： 同一批號(hào)試劑一個(gè)月后（28天） 7天后（放置儀器上的同一試劑盒） 根據(jù)要求進(jìn)行標(biāo)定：如質(zhì)控結(jié)果超出范圍時(shí) 根據(jù)規(guī)定進(jìn)行多次標(biāo)定。定標(biāo)確認(rèn):不需要。分析儀的軟件會(huì)自動(dòng)檢查定標(biāo)曲線

9、的有效性及偏離。5. 操作方法按儀器操作說(shuō)明進(jìn)行操作。檢查試劑與消耗品是否充足。使用前需混勻微粒。儀器通過(guò)掃描試劑盒條形碼自動(dòng)輸入測(cè)試所需的特異性參數(shù)，不需手工輸入。如果特殊情況下儀器無(wú)法閱讀條形碼，可以手工輸入15位數(shù)字。E170/Elecsys2010：將冷藏試劑預(yù)溫到20后放置于儀器的試劑盤上，避免產(chǎn)生泡沫。系統(tǒng)自動(dòng)控制試劑溫度和開/關(guān)試劑瓶蓋。將定標(biāo)液1和定標(biāo)液2放在分析儀的標(biāo)本測(cè)試區(qū)。只在標(biāo)定時(shí)打開瓶蓋。條形碼自動(dòng)提供定標(biāo)所需的數(shù)據(jù)資料。定標(biāo)完成后，將定標(biāo)液1和定標(biāo)液2放回28保存或丟棄(E170)。6. 質(zhì)量控制Elecsys Anti-HAV IgM質(zhì)控品。質(zhì)控品1和質(zhì)控品2至少

10、每24小時(shí)或每一次定標(biāo)后或每個(gè)試劑盒測(cè)定一次。質(zhì)控間隔期應(yīng)適用于各實(shí)驗(yàn)室的具體要求。檢測(cè)值應(yīng)落在范圍內(nèi)。如出現(xiàn)質(zhì)控值落在范圍以外，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立操作指南以采取校正措施。如果需要，樣本需要重新測(cè)試。7. 計(jì)算方法E170/Elecsys2010儀器會(huì)自動(dòng)根據(jù)Cal1和Cal2的測(cè)定值計(jì)算Cut-off值。每一個(gè)標(biāo)本的結(jié)果以“有反應(yīng)性”或“無(wú)反應(yīng)性”以及Cut-off指數(shù)形式報(bào)告。8. 參考范圍使用ElecsysAnti-HAV-IgM檢測(cè)，標(biāo)本的Cut-off指數(shù)1.0。這些樣本判斷為Anti-HAV IgM 陽(yáng)性。使用ElecsysAnti-HAV-IgM檢測(cè)，標(biāo)本的Cut-off指數(shù)4個(gè)月

11、)。有9份樣本是者用比較法檢測(cè)是陽(yáng)性或臨界，而用Elecsys Anti-HAV-IgM檢測(cè)為陰性。一份樣本使用Elecsys Anti-HAV-IgM檢測(cè)為弱陽(yáng)性，而比較法檢測(cè)為臨界，一份樣本使用ElecsysAnti-HAV-IgM檢測(cè)為陽(yáng)性，而比較法為陰性。用第三種檢測(cè)法檢測(cè)此早期血清轉(zhuǎn)換期樣本確認(rèn)為陽(yáng)性.臨床特異性:獻(xiàn)血者未經(jīng)篩選過(guò)的樣本進(jìn)行特異性檢測(cè)。共1032個(gè)獻(xiàn)血者樣本使用ElecsysAnti-HAV-IgM檢測(cè)均為陰性。 280/280例無(wú)甲肝病毒感染指征的住院病人、孕婦、透析病人,和藥物成隱者使用ElecsysAnti-HAV-IgM和Anti-HAV-IgM比較法檢測(cè)為陰

12、性，一例孕婦樣本用兩種方法檢測(cè)均為弱陽(yáng)性。兩種方法研究特異性為100%。95可信區(qū)間為99.7-100%。分析特異性:與Anti-HAV IgG、HBV、HCV、CMV、EBV、HSV、風(fēng)疹和弓形蟲沒(méi)有交叉反應(yīng)。共計(jì)9個(gè)上述抗原或抗體陽(yáng)性的血清和血漿樣本接受檢驗(yàn)評(píng)估（ANA、AMA）。【檢測(cè)范圍】3.00-60IU/l(由master定標(biāo)曲線的最低檢測(cè)限與最高檢測(cè)限決定)。如果測(cè)定值低于最低檢測(cè)限,報(bào)告為3.00IU/l. 如果測(cè)定值高于檢測(cè)范圍,報(bào)告60IU/l或者必需稀釋。特殊情況下,含抗HAV IgM的樣本稀釋后會(huì)出現(xiàn)非線性。【性能評(píng)估資料】精密度:下面為從Elecsys分析儀上獲得的評(píng)

13、估資料。不同的實(shí)驗(yàn)室獲得的資料可能會(huì)不同。用Elecsys試劑、人血清、質(zhì)控物(批內(nèi)n=21,批間n=10) 檢驗(yàn)它的重復(fù)性；在E170上檢測(cè)總的精密度，根據(jù)國(guó)際臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(National Committee for Clinical laboratory Standards)的修改草案(EP5-A)來(lái)檢驗(yàn):每日試驗(yàn)6次共進(jìn)行10天實(shí)驗(yàn)(n=60);下面為得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Elecsys2010批內(nèi)精密度批間精密度樣本平均值IU/lSDIU/lCV%平均值IU/lSDIU/lCV%HS,陰性3.00.29-3.00.69-HS,cut-off 域值17.60.221.218.40.74

14、4.0HS陽(yáng)性41.90.481.242.31.232.9質(zhì)控A-HAV120.90.401.921.70.813.7質(zhì)控A-HAV235.80.842.336.51.022.8E170批內(nèi)精密度總精密度樣本平均值IU/lSDIU/lCV%平均值IU/lSDIU/lCV%HS，陰性3.00.34-3.00.83-HS,cut-off 域值21.80.110.529.20.893.0HS陽(yáng)性55.20.300.551.31.122.2質(zhì)控A-HAV121.10.170.821.00.572.7質(zhì)控A-HAV235.20.230.734.80.561.6HS=人血清分析靈敏度:(最低檢測(cè)限)20I

15、U/L）。46例注射甲肝疫苗的病人中取165個(gè)樣本使用Elecsys Anti-HAV和購(gòu)買到的比較法檢測(cè)抗體濃度。所有樣本的抗體濃度均在域值以上。 臨床特異性:特異性研究，共1301例未被篩選過(guò)的鮮血者、住院病人、孕婦和透析病人(沒(méi)有甲肝感染的癥狀)，使用Elecsys Anti-HAV和商業(yè)提供的比較法檢測(cè)抗體濃度，沒(méi)有檢測(cè)到HAV陽(yáng)性。用Elecsys Anti-HAV方法,1286例結(jié)果20IU/L。在這個(gè)研究中,特異性為98.85%。95%的可信區(qū)間為98.11-99.35%。分析特異性:與HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、HSV、弓形蟲、風(fēng)疹和密螺旋體沒(méi)有交叉反應(yīng)。共計(jì)140

16、個(gè)Anti-HAV陰性的、上述抗原或抗體陽(yáng)性的血清和血漿樣本接受檢驗(yàn)評(píng)估（ANA、AMA）。10. 干擾因素該方法不受黃疸（膽紅素50mg/dl）、溶血（血紅蛋白1.75g/dl）、脂血（內(nèi)脂2000mg/dl）和生物素5mg/天）治療的病人，至少要等最后一次攝入生物素8小時(shí)后才能采血。類風(fēng)濕因子的濃度低于3200U/ml,沒(méi)有任何干擾。ElecsysAnti-HAV-IgM高劑量勾狀效應(yīng)不會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果.18種常用藥物經(jīng)體外試驗(yàn)對(duì)本測(cè)定無(wú)干擾。因?yàn)椴捎脝慰寺∈罂贵w進(jìn)行檢測(cè)，所以接受過(guò)小鼠單抗治療或診斷的病人可能會(huì)得出不正確的結(jié)果。罕見(jiàn)病例出現(xiàn)高濃度釕抗體和抗鏈霉親和素抗體干擾。Elecsy

17、s anti-HAV-IgM含的添加物會(huì)最小化這些影響。Elecsys 抗HAV IgM測(cè)定結(jié)果應(yīng)結(jié)合病人病史、臨床檢查和其他檢查結(jié)果綜合起來(lái)進(jìn)行診斷。11. 結(jié)果解釋使用ElecsysAnti-HAV-IgM檢測(cè)，標(biāo)本的Cut-off指數(shù)1.0。這些樣本判斷為Anti-HAV IgM 陽(yáng)性。使用ElecsysAnti-HAV-IgM檢測(cè)，標(biāo)本的Cut-off指數(shù)1.0。這些樣本判斷為Anti-HAV IgM 陰性。12. 臨床意義 甲肝病毒是一種沒(méi)有胞膜的RNA病毒。它屬于細(xì)小的核糖核酸病毒家族。至今，僅1種人血清型和7種基因型被記述。病毒衣殼由三種蛋白 (VP1-VP3) 組成，在病毒顆粒表面形成一個(gè)免疫決定簇結(jié)構(gòu)，它被高度表達(dá)在所有基