生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)四：氨基酸的紙上層析

1、實(shí)驗(yàn)四：氨基酸的紙上層析,Xiamen University,生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),2016年03月17日 廈門,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.掌握紙上層析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性顏色反應(yīng)。 3.學(xué)會(huì)分析未知樣品的氨基酸成分。,層析技術(shù)(chromatography 色譜技術(shù)),一、發(fā)展史： 層析分離技術(shù)在20世紀(jì)初就已得到應(yīng)用： 1903年用于植物色素的分離； 1931年用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體； 1944年出現(xiàn)了以濾紙作為支持物的紙層析； 20世紀(jì)六十年代末出現(xiàn)了高效液相色譜(HPLC)。,二、實(shí)驗(yàn)原理,層析技術(shù)， (chromatography 色譜技術(shù)) 是利用被分離

2、的混合物中各組分的理化性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同程度在流動(dòng)相和固定相中進(jìn)行分配，最終達(dá)到分離目的。,層析技術(shù)的種類 1、按流動(dòng)相的狀態(tài)分類： (1)液相層析(色譜) (2)氣相層析(色譜)； 2、按固定相的使用形式分類： (1)柱層析(CC) (2)紙層析(PC) (3)薄層層析(TLC)； 3、按分離過程所主要依據(jù)的物理化學(xué)性質(zhì)分類： (1)吸附層析 (2)分配層析 (3)離子交換層析 (4)凝膠層析 (5)親和層析等。,紙上層析法是分配層析法中的一種，常以濾紙為惰性支持物。紙上層析法是分離、鑒定和定量測(cè)定氨基酸、糖類、抗生素等有

3、機(jī)物質(zhì)的一項(xiàng)重要而簡(jiǎn)便的分析方法。所用設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，使用樣品少，分離效果好，為近代生物化學(xué)分析中重要技術(shù)之一。此法廣泛地應(yīng)用于科研和生產(chǎn)分析工作中。缺點(diǎn)是展開時(shí)間較長。,常以水和有機(jī)溶劑作為展層劑；水和有機(jī)溶劑互溶后形成兩個(gè)相：一個(gè)是飽和了有機(jī)溶劑后的水相, 一個(gè)是飽和了水后的有機(jī)溶劑相。由于濾紙纖維素上的羥基和水分子有較大的親和力, 其吸附的水相為固定相, 有機(jī)溶劑相為移動(dòng)相。 由于物質(zhì)的極性大小不同,在兩相中分配比例有所差異。極性小的物質(zhì)在有機(jī)相中分配較多,隨有機(jī)相移動(dòng)較快；而極性大的物質(zhì)在水相中分配較多,移動(dòng)相對(duì)較慢,從而將極性不同的物質(zhì)分開,分配層析法： 利用物質(zhì)在兩種或兩種以上

4、不同的混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而達(dá)到分離目的的一種實(shí)驗(yàn)方法。 在一定條件下，一種物質(zhì)在某種溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)是一個(gè)常數(shù)即: =溶質(zhì)在固定相的濃度（Cs）/溶質(zhì)在流動(dòng)相的濃度（Cl）,在相同的條件下，每種物質(zhì)都有其固定的Rf值。 Rf值的定義為： 原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離 Rf = 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離,影響Rf值的因素有： 物質(zhì)本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)； 展層所用溶劑系統(tǒng)； 展層劑pH值； 展層時(shí)的溫度； 展層所用濾紙； 展層的方向(橫向，上行或下行)。 用紙層析鑒定樣品時(shí)，一般都與標(biāo)準(zhǔn)品相比較。若沒有標(biāo)準(zhǔn)品，可選擇文獻(xiàn)記載的該物質(zhì)層析條件，根據(jù)文獻(xiàn)Rf值進(jìn)行鑒定。,影響Rf值的主要因素： Rf決定

5、于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及 兩相間的體積比。由于在同一實(shí)驗(yàn)條件下，兩相體 積比是一常數(shù)，所以主要決定于分配系數(shù)。不同物 質(zhì)分配系數(shù)不同，Rf也就不同。 （1）物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性： 物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同極性不同，在兩相中的溶解度也 就不同，物質(zhì)的極性決定了物質(zhì)在水和有機(jī)溶劑之間 的分配情況，極性大的易溶于水中即固定相中，Rf ?。环粗?Rf則較大。,（2）層析溶劑： 首先，溶劑的純度要高,否則需經(jīng)預(yù)先處理（酸堿抽提，重蒸餾，脫水干燥等）； 其次，溶劑系統(tǒng)選擇應(yīng)考慮被分離的物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的Rf在0.050.85，樣品被分離物質(zhì)的組分的Rf之差最好大于0.05； 再次，有些溶劑系統(tǒng)必須新鮮配制

6、，如正丁醇- 甲酸-水系統(tǒng)久放易引起酯化.,（3）pH值： 溶劑、濾紙和樣品的pH值都會(huì)影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使Rf改變； 溶劑的pH還可以影響流動(dòng)相的含水量，溶劑的酸堿度大，吸水量多，使極性物質(zhì)的Rf增加（將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理）.,（4）濾紙： 層析濾紙由高純度棉花制成，要求濾紙要清潔，質(zhì)地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，要被溶劑所飽和。不同型號(hào)的濾紙，其厚薄程度、纖維松緊度各不相同，因此，濾紙纖維結(jié)合水的量不一樣，兩相的體積比也就不同，Rf也不同； 另外，濾紙的雜質(zhì)也會(huì)影響Rf，必要時(shí)進(jìn)行預(yù)處理（可用0.010.4M的HCl處理除去金屬離子）

7、.,（5）室驗(yàn)室的溫度和時(shí)間: 溫度影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響分配系數(shù)； 也影響濾紙纖維的水合作用，影響固定相的體積；也顯 著地影響溶劑系統(tǒng)的含水量，即影響流動(dòng)相的組分比例。 層析必須在恒溫條件下進(jìn)行，某些對(duì)溫度敏感的溶劑系 統(tǒng)，最好不配制成飽和溶液。 層析時(shí)間長,Rf大。,（6）展開方式： 上行法Rf??；下行法（層析缸上部有一盛展開劑的液槽，濾紙點(diǎn)樣端向上進(jìn)入槽中，重現(xiàn)性差，斑點(diǎn)易擴(kuò)散） Rf大；環(huán)行法（最好用無方向性的特制濾紙）用圓形濾紙層析時(shí)，由于內(nèi)圈較外圈小，限制了溶劑的流動(dòng)，Rf較小。 （7）樣品溶液中雜質(zhì)： 如氯化鈉的存在會(huì)影響氨基酸的Rf值。,三、儀器與試劑： 儀器 層析缸

8、1個(gè)； 培養(yǎng)皿1付； 噴霧器（公用）； 恒溫干燥箱（公用）； 毛細(xì)管 若干； 電吹風(fēng)（公用）； 新華一號(hào)濾紙、針線； 50ml 燒杯2個(gè)。,試劑： 第一相溶劑：正丁醇：12% NH4OH：95%乙醇=13：3：3（V/V）；配置1.2L 0.5%茚三酮無水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml無水丙酮，貯于棕色瓶。 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸：精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸（難溶）。0.2g溶于100ml蒸餾水中 混合氨基酸。取兩種氨基酸各0.2g溶于100ml蒸餾水中,四、實(shí)驗(yàn)操作 1、紙的處理 取14 cm長、12 cm寬的濾紙一張，離底邊2 cm處用鉛筆輕輕劃一條與底邊平行的線，并等距離的在線上定點(diǎn)樣

9、點(diǎn)(原點(diǎn))劃圈，使圈的直徑小于0.4 cm。 2、點(diǎn)樣 用毛細(xì)管點(diǎn)樣，中間點(diǎn)混合氨基酸，兩側(cè)點(diǎn)三種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸；每個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)重復(fù)點(diǎn)2-3次，每點(diǎn)一次用電吹風(fēng)吹干后再點(diǎn)下次(此時(shí)，用冷風(fēng)吹干，防止氨基酸變性降解)，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑應(yīng)控制在2-4mm左右，點(diǎn)樣完畢用大頭針線將濾紙做成筒形，點(diǎn)樣面向外。,圖1. 點(diǎn) 樣,2cm,將點(diǎn)好的濾紙延長邊方向卷成筒行，用紗線縫合(紙的兩邊不能重合)，然后將濾紙放在層析缸中的培養(yǎng)皿邊上(培養(yǎng)皿預(yù)先倒入第一相溶劑)，密閉缸蓋，平衡30min(注忌勿使濾紙接觸到溶劑)，然后按圖2-2將濾紙平放在培養(yǎng)皿內(nèi)的溶劑中，進(jìn)行層析。(注:液面應(yīng)低于原點(diǎn)),圖2. 濾紙的縫合,3、平

10、衡 點(diǎn)樣以后將濾紙與層析缸用配好的溶劑系統(tǒng)蒸汽來飽和，這個(gè)過程稱為平衡(30min) ,否則，濾紙會(huì)從溶劑中吸收水分，溶劑也會(huì)從濾紙表面揮發(fā)，使溶劑系統(tǒng)的組分發(fā)生改變，嚴(yán)重時(shí)紙上會(huì)出現(xiàn)不同水平的溶劑前沿，影響層析效果。 4、展層 向?qū)游龈字屑尤雽游鋈軇?高約1.5cm) ，液層不要超過點(diǎn)樣線，將濾紙點(diǎn)樣點(diǎn)朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達(dá)濾紙上邊線1-2cm時(shí)取出冷風(fēng)吹干。,5、顯色 用噴霧器向?yàn)V紙上均勻噴灑0.1%茚三酮，熱風(fēng)吹干(加快反應(yīng))反應(yīng)顯色(或晾干后，將濾紙放入烘箱中80-100，烘烤5min后 )，濾紙上即顯出紫紅色或黃色的氨基酸斑點(diǎn)。 四、結(jié)果處理 1、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點(diǎn)描出來。 2、測(cè)量原點(diǎn)至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計(jì)算各種已知氨基酸和未知氨基酸色譜的Rf值。 3、分析混合樣品中未知氨基酸的組分。,圖3. 層析譜1原點(diǎn)；2層析點(diǎn)；3溶劑前沿,五、注意事項(xiàng) (1) 在整個(gè)操作過程中，手只能接觸濾紙邊緣，否則手指上的氨基酸會(huì)造成濾紙上眾多斑點(diǎn)?？p合時(shí)要對(duì)齊，否則會(huì)跑歪 (2) 在點(diǎn)樣時(shí)，不要將毛細(xì)管插錯(cuò)了試劑瓶。 (3) 點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大(其直徑應(yīng)小于0.5c