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文檔簡介
1、基因操作,第七章,Gene Manipulating,2021年4月8日1時27分,1,第二節(jié),PCR 技術(shù)的原理與應用 Polymerase Chain Reaction,江黎明 2013年10月,2021年4月8日1時27分,2,PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)是1985年由美國科學家Kary B Mullis發(fā)明的體外基因片段擴增的方法。,一、PCR技術(shù)的產(chǎn)生,2021年4月8日1時27分,3,PCR技術(shù)的創(chuàng)建,Kary B. Mullis(穆利斯(美),1971年,Khorana等提出在體外DNA經(jīng)變性,與適當引 物雜交后用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的
2、設想。,1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)。,1988年,Saiki等將耐熱DNA聚合酶(Taq)引入PCR技。,1989年,美國Science雜志列PCR 為十余項重大科 學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年。,1993年,Mullis榮獲度諾貝爾化學獎。,2021年4月8日1時27分,4,二、PCR技術(shù)的基本原理,DNA模板變性 (denature):,95左右高溫使模板DNA完全變性。,單鏈DNA模板與引物退火 (annealing):,55左右引物與模板形成復合物的幾率DNA分子自身的復性。,引物的延伸 (extension):,72左右耐熱DNA聚合酶在最適溫度下催化DNA
3、合成反應。,2021年4月8日1時27分,5,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR技術(shù)的基本原理示意圖,Taq酶,Taq酶,2021年4月8日1時27分,6,2021年4月8日1時27分,7,PCR體系的5種基本組成成分,2021年4月8日1時27分,8,PCR反應循環(huán),變性 9395C左右,延伸 酶最適溫度,退火 引物Tm-5C,經(jīng)過30個左右的循環(huán)后,模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。,2021年4月8日1時27分,9,思考題 1,PCR技術(shù)的主要特點,1.特異性強,2.靈敏度高,3.簡便快速,4.對標本的純度要求低,2021年4月8日
4、1時27分,10,衡量PCR好壞的參數(shù):,特異性Specificity:最好只有目的DNA帶。,真實性Fidelity:DNA序列正確。,產(chǎn)量Quantity:DNA帶明亮。,2021年4月8日1時27分,11,思考題 2,利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模 板獲得已知目的基因片段。,利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中 獲得具有一定同源性的基因片段。,利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中 隨機克隆基因。,用不同引物進行PCR獲取目的基因:,三、PCR技術(shù)的主要用途及其衍生技術(shù),(一)目的基因的克隆,2021年4月8日1時27分,12,(reverse transcriptio
5、n PCR,RT-PCR),1.反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),特點:敏感度高、特異性強、省時等。,RT-PCR是從組織細胞中獲得目的基因、對已知 序列RNA進行定性及半定量分析最的有效方法。,總RNA (或mRNA),ss-cDNA,ds-cDNA,PCR擴增,2021年4月8日1時27分,13,獲取目的基因的特殊PCR技術(shù):,RT-PCR原理,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,雙鏈cDNA,3,5,3,5,5,加熱變性,加入特異性引物,DNA聚合酶,PCR,大量的產(chǎn)物,202
6、1年4月8日1時27分,14,RT-PCR的結(jié)果舉例,2021年4月8日1時27分,15,gt10/11系列 (插入型,適用于cDNA克隆),4/8/2021 1:27 PM,16,重組噬菌體,錨定PCR,末端核酸轉(zhuǎn)移酶,先合成第一鏈cDNA后,添加一同聚物尾(polydG),與帶有polydC 限制性內(nèi)切位點的3錨定引物一起擴增。,2021年4月8日1時27分,17,原理:,設計“內(nèi)、外” 兩對引物:,2.巢式-PCR(nested-PCR),先用外引物進行PCR反應,從模板上擴增出含有內(nèi)引物擴增的靶序列的較長產(chǎn)物,并以此作為模板用內(nèi)引物進行第二次PCR反應,擴增出內(nèi)側(cè)的較短靶序列。,外引物
7、對應的序列在模板的外側(cè); 內(nèi)引物對應的序列在外引物的內(nèi)側(cè)。,2021年4月8日1時27分,18,第1輪PCR:1520個循環(huán)的標準擴增。,第2輪PCR:將第1輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋1001000倍, 作為模板進行第2輪PCR ,擴增1520個循環(huán)。,2021年4月8日1時27分,19,降低了多個靶位點擴增的可能性,因與2套引物都互補的靶序列很少。如用相同引物對作總數(shù)相同的循環(huán),會擴增非特異性靶點。,可增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的靈敏度,并且提高了困難PCR(如5 RACE)的特異性。,用外、內(nèi)2對引物擴增,可大大提高擴增的靈敏度和特異性。,2021年4月8日1時27分,20,3.cDNA
8、末端快速擴增,2021年4月8日1時27分,21,3-RACE,2021年4月8日1時27分,22,5-RACE,5-cap,AAAAAAAAAA3,mRNA,GSP1,1.逆轉(zhuǎn)錄,去除RNA和GSP1,2.末端轉(zhuǎn)移酶,3CCCCC,3CCCCC,3.退火,PCR,GSP2,5GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3,Xho l Sal I ClaI,3. PCR,用限制性內(nèi)切酶切割克隆即獲得5末端片段,2021年4月8日1時27分,23,2021年4月8日1時27分,24,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,連接酶,4.反向PCR (reverse PCR),用反向的互補
9、引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。,2021年4月8日1時27分,25,電泳,*2,3雙脫氧核苷酸,*用4種不同熒光標記,DNA樣品 引物、DNA聚合酶、dNTP,A,A,C,G,T,G,G,A,C,T,末端合成終止法測定DNA序列的原理,DNA自動測序結(jié)果,2021年4月8日1時27分,27,The Nobel Prize in Chemistry 1980,for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recom
10、binant-DNA,for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids,Paul Berg,1/2 of the prize,Stanford University Stanford, CA, USA,1926 -,Walter Gilbert Frederick Sanger,1/4 of the prize 1/4 of the prize,Harvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USA,
11、MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom,1932 -,1918 -,2021年4月8日1時27分,28,(二)基因的體外突變,利用PCR技術(shù)可以隨意設計引物在體外進行基因的嵌和、缺失、點突變等改造。,利用PCR技術(shù)構(gòu)建重組體和突變體的方法稱為重組PCR(recombinant PCR)。,特點是簡單、省時;利用兩對引物很容易的在DNA片段的任何位置進行點突變。,2021年4月8日1時27分,29,1. 隨機突變:,應用:,策略:易錯PCR(error-prone PCR)。,利用Taq DNA聚合酶等沒有35校
12、對功能的特性,在PCR擴增反應中可能摻入錯誤的核苷酸,產(chǎn)生隨機錯誤的擴增產(chǎn)物。,加入ITP并限制某一種核苷酸用量,從而促進DNA聚合酶選擇其它3種核苷酸或ITP,導致產(chǎn)物發(fā)生突變。,構(gòu)建突變體文庫,繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個體,2021年4月8日1時27分,30,2.定點點突變,(1) 5端引入點突變:,(2) 序列中的點突變:,通過修飾上游引物的5端的堿基序列,可引入標記的堿基、限制性酶切位點、啟動子序列等。,采用重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR,OE PCR。,2021年4月8日1時27分,31,用酶A和B消化、克隆,將突變位點引入PCR重組體。,(1)
13、 末端引入點突變,2021年4月8日1時27分,32,EcoRI,HindIII,digest, subclone sequence,PvuII,(2) 序列中的點突變:,2021年4月8日1時27分,33,例子:S.pn的ply146aa缺失的突變序列構(gòu)建,肺炎鏈球菌S.Pn的ply為一細胞毒性分子,其146位aa缺失后毒性大大減弱。構(gòu)建突變體作為疫苗:,首先設計4個引物:(M1和M2完全重疊),P1: 5-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH I,P2: 5-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho I,M1: 5-G
14、GTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3,M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3,2021年4月8日1時27分,34,以基因組DNA為模板,以P1和M1為引物擴增出ply上游片斷,以P2和M2為引物擴增出ply下游片斷;,2.以上下游片斷為模板,以P1和P2為引物擴出全長;,3.酶切后克隆到質(zhì)粒中保存。,2021年4月8日1時27分,35,A,B,3.引入大片段缺失,2021年4月8日1時27分,36,4.多位點突變,策略:多次重疊PCR,關(guān)鍵:重疊引物設計(每對均需部分重疊,方向相反)。,2021年4月8日1時27分,37,基本操作
15、,2021年4月8日1時27分,38,(三)DNA的微量分析,PCR技術(shù)敏感度很高,理論上只要存在1分子的模板,就可以獲得目的片段,是DNA微量分析的最好方法。,實際工作中,1滴血液、1根毛發(fā)或1個細胞已足以滿足PCR的檢測需要。,2021年4月8日1時27分,39,(四)mRNA的含量分析,用于RNA檢測的常用字方法有原位雜交、點雜交、Northern印跡雜交及核酸酶保護試驗等,都難以檢測低豐度的mRNA,且操作繁瑣。,在敏感性方面,RT- PCR用于mRNA定量分析要遠高于上述傳統(tǒng)方法。,RT-PCR用于mRNA定量分析面臨的問題:,在第一步合成cDNA的反應中會造成一些誤差,但是更重要和
16、顯著的誤差是由PCR反應本身造成。,2021年4月8日1時27分,40,用于定量PCR分析的兩種技術(shù):,競爭性定量PCR:,在反應前加入外源標準品RNA作為內(nèi)參照;須使用與樣品RNA同樣的引物識別序列,但產(chǎn)物的大小不同,以在電泳時區(qū)別開。,屬反應終點分析方法,需用系列稀釋標準RNA做成標準曲線,樣品RNA的含量應在標準曲線范圍內(nèi)。,實時PCR(real time PCR):,是近年發(fā)展起來的一種RNA微量分析技術(shù);精確度高,結(jié)果明確,操作容易,能進行高通量檢測。,2021年4月8日1時27分,41,實時PCR的基本原理,在反應中引入了熒光標記分子,在反應過程中對反應過程中每一時刻的產(chǎn)物量進行實
17、時分析。,不同公司的儀器和反應系統(tǒng)所用的熒光報告系統(tǒng)不同:,Molecular Probe 公司的SYBR Green 系統(tǒng),Perkin-Elmer/ABD公司的TaqMan系統(tǒng),Invitrogen公司的Molecular Beacons系統(tǒng),2021年4月8日1時27分,42,原理:,PCR擴增時,Taq酶的5- 3外切酶活性將探針酶切降解,使探針上的熒光基團和淬滅基團分離,使熒光基團在激發(fā)光作用下發(fā)出熒光; 每擴增一條DNA鏈就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。,2021年4月8日1時27分,43,思考題 3,1.實時熒光PCRTaqMan技術(shù),實時熒光
18、PCRTaqMan技術(shù),2021年4月8日1時27分,44,TaqMan技術(shù)的優(yōu)、缺點,優(yōu)點:雜交效率高,2021年4月8日1時27分,45,X,2.實時熒光PCR分子信標技術(shù),2021年4月8日1時27分,46,分子信標技術(shù)的優(yōu)、缺點,2021年4月8日1時27分,47,SYBRGreenI是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料,當它與DNA雙鏈結(jié)合時,發(fā)出熒光;從DNA雙鏈上釋放出來時,熒光信號急劇減弱。,因此,在一個體系內(nèi),其信號強度代表了雙鏈DNA的量。,3.實時熒光PCRSYBR Green I 技術(shù),2021年4月8日1時27分,48,SYBRGreenI熒光染料的作用原理,2021年4月8日1時27分,49,SYBR Green I 技術(shù)的優(yōu)、缺點,2021年4月8日1時27分,50,熒光曲線,隨著PCR反應的進行,擴增產(chǎn)物不斷累積,熒光信號強度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一次熒光強度信號,得到一條熒光擴增曲線圖,4.實時定量PCR的定量原理,2021年4月8日1時27分,51,熒光閾值,在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定一個熒光強度標準(即PCR擴增產(chǎn)物量的標準)。,閾值線,實時定量PCR的兩個重要概念,2021年4月8日1時27分,52,Ct值的概念,Ct值的定義是PCR擴增過程中,擴增產(chǎn)物(熒光信號)到達閾值時所經(jīng)過的擴增
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