【教學(xué)課件】第7章_第2節(jié)_PCR技術(shù)(3_LMJ)'

1、基因操作,第七章,Gene Manipulating,2021年4月8日1時(shí)27分,1,第二節(jié),PCR 技術(shù)的原理與應(yīng)用 Polymerase Chain Reaction,江黎明 2013年10月,2021年4月8日1時(shí)27分,2,PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)是1985年由美國(guó)科學(xué)家Kary B Mullis發(fā)明的體外基因片段擴(kuò)增的方法。,一、PCR技術(shù)的產(chǎn)生,2021年4月8日1時(shí)27分,3,PCR技術(shù)的創(chuàng)建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,1971年,Khorana等提出在體外DNA經(jīng)變性,與適當(dāng)引 物雜交后用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的

2、設(shè)想。,1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)。,1988年,Saiki等將耐熱DNA聚合酶(Taq)引入PCR技。,1989年,美國(guó)Science雜志列PCR 為十余項(xiàng)重大科 學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年。,1993年,Mullis榮獲度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,2021年4月8日1時(shí)27分,4,二、PCR技術(shù)的基本原理,DNA模板變性 (denature)：,95左右高溫使模板DNA完全變性。,單鏈DNA模板與引物退火 (annealing)：,55左右引物與模板形成復(fù)合物的幾率DNA分子自身的復(fù)性。,引物的延伸 (extension)：,72左右耐熱DNA聚合酶在最適溫度下催化DNA

3、合成反應(yīng)。,2021年4月8日1時(shí)27分,5,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR技術(shù)的基本原理示意圖,Taq酶,Taq酶,2021年4月8日1時(shí)27分,6,2021年4月8日1時(shí)27分,7,PCR體系的5種基本組成成分,2021年4月8日1時(shí)27分,8,PCR反應(yīng)循環(huán),變性 9395C左右,延伸 酶最適溫度,退火 引物Tm-5C,經(jīng)過(guò)30個(gè)左右的循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。,2021年4月8日1時(shí)27分,9,思考題 1,PCR技術(shù)的主要特點(diǎn),1.特異性強(qiáng),2.靈敏度高,3.簡(jiǎn)便快速,4.對(duì)標(biāo)本的純度要求低,2021年4月8日

4、1時(shí)27分,10,衡量PCR好壞的參數(shù)：,特異性Specificity:最好只有目的DNA帶。,真實(shí)性Fidelity:DNA序列正確。,產(chǎn)量Quantity:DNA帶明亮。,2021年4月8日1時(shí)27分,11,思考題 2,利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模 板獲得已知目的基因片段。,利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中 獲得具有一定同源性的基因片段。,利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中 隨機(jī)克隆基因。,用不同引物進(jìn)行PCR獲取目的基因：,三、PCR技術(shù)的主要用途及其衍生技術(shù),（一）目的基因的克隆,2021年4月8日1時(shí)27分,12,(reverse transcriptio

5、n PCR,RT-PCR),1.反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),特點(diǎn)：敏感度高、特異性強(qiáng)、省時(shí)等。,RT-PCR是從組織細(xì)胞中獲得目的基因、對(duì)已知 序列RNA進(jìn)行定性及半定量分析最的有效方法。,總RNA (或mRNA),ss-cDNA,ds-cDNA,PCR擴(kuò)增,2021年4月8日1時(shí)27分,13,獲取目的基因的特殊PCR技術(shù)：,RT-PCR原理,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,雙鏈cDNA,3,5,3,5,5,加熱變性,加入特異性引物,DNA聚合酶,PCR,大量的產(chǎn)物,202

6、1年4月8日1時(shí)27分,14,RT-PCR的結(jié)果舉例,2021年4月8日1時(shí)27分,15,gt10/11系列 (插入型，適用于cDNA克隆),4/8/2021 1:27 PM,16,重組噬菌體,錨定PCR,末端核酸轉(zhuǎn)移酶,先合成第一鏈cDNA后,添加一同聚物尾(polydG),與帶有polydC 限制性內(nèi)切位點(diǎn)的3錨定引物一起擴(kuò)增。,2021年4月8日1時(shí)27分,17,原理：,設(shè)計(jì)“內(nèi)、外” 兩對(duì)引物：,2.巢式-PCR（nested-PCR）,先用外引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，從模板上擴(kuò)增出含有內(nèi)引物擴(kuò)增的靶序列的較長(zhǎng)產(chǎn)物，并以此作為模板用內(nèi)引物進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出內(nèi)側(cè)的較短靶序列。,外引物

7、對(duì)應(yīng)的序列在模板的外側(cè)； 內(nèi)引物對(duì)應(yīng)的序列在外引物的內(nèi)側(cè)。,2021年4月8日1時(shí)27分,18,第1輪PCR：1520個(gè)循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增。,第2輪PCR：將第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1001000倍， 作為模板進(jìn)行第2輪PCR ，擴(kuò)增1520個(gè)循環(huán)。,2021年4月8日1時(shí)27分,19,降低了多個(gè)靶位點(diǎn)擴(kuò)增的可能性，因與2套引物都互補(bǔ)的靶序列很少。如用相同引物對(duì)作總數(shù)相同的循環(huán)，會(huì)擴(kuò)增非特異性靶點(diǎn)。,可增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的靈敏度，并且提高了困難PCR(如5 RACE)的特異性。,用外、內(nèi)2對(duì)引物擴(kuò)增，可大大提高擴(kuò)增的靈敏度和特異性。,2021年4月8日1時(shí)27分,20,3.cDNA

8、末端快速擴(kuò)增,2021年4月8日1時(shí)27分,21,3-RACE,2021年4月8日1時(shí)27分,22,5-RACE,5-cap,AAAAAAAAAA3,mRNA,GSP1,1.逆轉(zhuǎn)錄,去除RNA和GSP1,2.末端轉(zhuǎn)移酶,3CCCCC,3CCCCC,3.退火，PCR,GSP2,5GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3,Xho l Sal I ClaI,3. PCR,用限制性內(nèi)切酶切割克隆即獲得5末端片段,2021年4月8日1時(shí)27分,23,2021年4月8日1時(shí)27分,24,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,連接酶,4.反向PCR (reverse PCR),用反向的互補(bǔ)

9、引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。,2021年4月8日1時(shí)27分,25,電泳,*2，3雙脫氧核苷酸,*用4種不同熒光標(biāo)記,DNA樣品 引物、DNA聚合酶、dNTP,A,A,C,G,T,G,G,A,C,T,末端合成終止法測(cè)定DNA序列的原理,DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果,2021年4月8日1時(shí)27分,27,The Nobel Prize in Chemistry 1980,for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recom

10、binant-DNA,for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids,Paul Berg,1/2 of the prize,Stanford University Stanford, CA, USA,1926 -,Walter Gilbert Frederick Sanger,1/4 of the prize 1/4 of the prize,Harvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USA,

11、MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom,1932 -,1918 -,2021年4月8日1時(shí)27分,28,（二）基因的體外突變,利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外進(jìn)行基因的嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。,利用PCR技術(shù)構(gòu)建重組體和突變體的方法稱為重組PCR(recombinant PCR)。,特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、省時(shí)；利用兩對(duì)引物很容易的在DNA片段的任何位置進(jìn)行點(diǎn)突變。,2021年4月8日1時(shí)27分,29,1. 隨機(jī)突變：,應(yīng)用：,策略：易錯(cuò)PCR（error-prone PCR）。,利用Taq DNA聚合酶等沒(méi)有35校

12、對(duì)功能的特性，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中可能摻入錯(cuò)誤的核苷酸，產(chǎn)生隨機(jī)錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物。,加入ITP并限制某一種核苷酸用量，從而促進(jìn)DNA聚合酶選擇其它3種核苷酸或ITP，導(dǎo)致產(chǎn)物發(fā)生突變。,構(gòu)建突變體文庫(kù)，繼而可從中篩選出具有特殊性質(zhì)的突變個(gè)體,2021年4月8日1時(shí)27分,30,2.定點(diǎn)點(diǎn)突變,(1) 5端引入點(diǎn)突變：,(2) 序列中的點(diǎn)突變：,通過(guò)修飾上游引物的5端的堿基序列，可引入標(biāo)記的堿基、限制性酶切位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列等。,采用重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR。,2021年4月8日1時(shí)27分,31,用酶A和B消化、克隆，將突變位點(diǎn)引入PCR重組體。,(1)

13、 末端引入點(diǎn)突變,2021年4月8日1時(shí)27分,32,EcoRI,HindIII,digest, subclone sequence,PvuII,(2) 序列中的點(diǎn)突變：,2021年4月8日1時(shí)27分,33,例子：S.pn的ply146aa缺失的突變序列構(gòu)建,肺炎鏈球菌S.Pn的ply為一細(xì)胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大減弱。構(gòu)建突變體作為疫苗：,首先設(shè)計(jì)4個(gè)引物：(M1和M2完全重疊),P1: 5-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH I,P2: 5-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho I,M1: 5-G

14、GTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3,M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3,2021年4月8日1時(shí)27分,34,以基因組DNA為模板，以P1和M1為引物擴(kuò)增出ply上游片斷，以P2和M2為引物擴(kuò)增出ply下游片斷；,2.以上下游片斷為模板，以P1和P2為引物擴(kuò)出全長(zhǎng)；,3.酶切后克隆到質(zhì)粒中保存。,2021年4月8日1時(shí)27分,35,A,B,3.引入大片段缺失,2021年4月8日1時(shí)27分,36,4.多位點(diǎn)突變,策略：多次重疊PCR,關(guān)鍵：重疊引物設(shè)計(jì)(每對(duì)均需部分重疊，方向相反)。,2021年4月8日1時(shí)27分,37,基本操作

15、,2021年4月8日1時(shí)27分,38,（三）DNA的微量分析,PCR技術(shù)敏感度很高，理論上只要存在1分子的模板，就可以獲得目的片段，是DNA微量分析的最好方法。,實(shí)際工作中，1滴血液、1根毛發(fā)或1個(gè)細(xì)胞已足以滿足PCR的檢測(cè)需要。,2021年4月8日1時(shí)27分,39,（四）mRNA的含量分析,用于RNA檢測(cè)的常用字方法有原位雜交、點(diǎn)雜交、Northern印跡雜交及核酸酶保護(hù)試驗(yàn)等，都難以檢測(cè)低豐度的mRNA，且操作繁瑣。,在敏感性方面，RT- PCR用于mRNA定量分析要遠(yuǎn)高于上述傳統(tǒng)方法。,RT-PCR用于mRNA定量分析面臨的問(wèn)題：,在第一步合成cDNA的反應(yīng)中會(huì)造成一些誤差，但是更重要和

16、顯著的誤差是由PCR反應(yīng)本身造成。,2021年4月8日1時(shí)27分,40,用于定量PCR分析的兩種技術(shù)：,競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR：,在反應(yīng)前加入外源標(biāo)準(zhǔn)品RNA作為內(nèi)參照；須使用與樣品RNA同樣的引物識(shí)別序列，但產(chǎn)物的大小不同，以在電泳時(shí)區(qū)別開。,屬反應(yīng)終點(diǎn)分析方法，需用系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)RNA做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品RNA的含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。,實(shí)時(shí)PCR(real time PCR)：,是近年發(fā)展起來(lái)的一種RNA微量分析技術(shù)；精確度高，結(jié)果明確，操作容易，能進(jìn)行高通量檢測(cè)。,2021年4月8日1時(shí)27分,41,實(shí)時(shí)PCR的基本原理,在反應(yīng)中引入了熒光標(biāo)記分子，在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)反應(yīng)過(guò)程中每一時(shí)刻的產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)

17、時(shí)分析。,不同公司的儀器和反應(yīng)系統(tǒng)所用的熒光報(bào)告系統(tǒng)不同：,Molecular Probe 公司的SYBR Green 系統(tǒng),Perkin-Elmer/ABD公司的TaqMan系統(tǒng),Invitrogen公司的Molecular Beacons系統(tǒng),2021年4月8日1時(shí)27分,42,原理:,PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5- 3外切酶活性將探針酶切降解，使探針上的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，使熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下發(fā)出熒光； 每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。,2021年4月8日1時(shí)27分,43,思考題 3,1.實(shí)時(shí)熒光PCRTaqMan技術(shù),實(shí)時(shí)熒光

18、PCRTaqMan技術(shù),2021年4月8日1時(shí)27分,44,TaqMan技術(shù)的優(yōu)、缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：雜交效率高,2021年4月8日1時(shí)27分,45,X,2.實(shí)時(shí)熒光PCR分子信標(biāo)技術(shù),2021年4月8日1時(shí)27分,46,分子信標(biāo)技術(shù)的優(yōu)、缺點(diǎn),2021年4月8日1時(shí)27分,47,SYBRGreenI是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料，當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。,因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA的量。,3.實(shí)時(shí)熒光PCRSYBR Green I 技術(shù),2021年4月8日1時(shí)27分,48,SYBRGreenI熒光染料的作用原理,2021年4月8日1時(shí)27分,49,SYBR Green I 技術(shù)的優(yōu)、缺點(diǎn),2021年4月8日1時(shí)27分,50,熒光曲線,隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖,4.實(shí)時(shí)定量PCR的定量原理,2021年4月8日1時(shí)27分,51,熒光閾值,在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))。,閾值線,實(shí)時(shí)定量PCR的兩個(gè)重要概念,2021年4月8日1時(shí)27分,52,Ct值的概念,Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號(hào))到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增