免疫組化SP法與SABC

1、ABC法：ABC代表的是親和素一生物素一過氧化物酶復(fù)合物。利用抗生物素分別 連接生物素標(biāo)記的笫二抗和生物素標(biāo)記的酶。但是此法注意源性生物素活性的消 除，以減少非特異性的染色。SP法：是采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋口連接的堿性磷酸酶 及底物色素混合液來測(cè)定細(xì)胞或組織中的抗原。PA是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞 壁分離的蛋白質(zhì)，它能與各種動(dòng)物的IGG的FC段結(jié)合，在免疫組化中可作為橋 抗體或標(biāo)記抗體。最大的優(yōu)點(diǎn)是不受種屬的特異性限制。此法還具有染色時(shí)間 短、靈敬度高、背景染色淡等優(yōu)點(diǎn)，分子量小，易于穿透組織。兩者本質(zhì)的區(qū)別是：SABC法的“三抗”是SABC復(fù)合物即鏈酶親和素一生物素一 過氧

2、化物酶復(fù)合物；而SP法的“三抗”是過氧化物酶直接與鏈酶 親和素相連 的，沒有通過生物素的中介連接。SABC步驟：切片常規(guī)脫蠟、脫水；30%H202 +蒸謂水10份混合，室溫5-10分鐘以滅活源 性酶，蒸憎水洗；將切片浸入0. 01M枸椽酸鹽（PH6.0）,微波爐加熱至沸騰后 斷電，間隔10分鐘，反復(fù)兩次進(jìn)行熱修復(fù)抗原；滴加5%BSA封閉液，室溫20 分鐘；滴加一抗，37C1小時(shí)30分鐘孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,室 溫下20分鐘，PBS （PH7.2-7.6）洗；滴加試劑SABC,室溫下20分鐘,PBS洗 5分鐘X4次；DAB顯色：取lml蒸憾水，加試劑盒中A, B, C試劑各1滴，混

3、 勻后加至切片，室溫顯色18分鐘；木素輕度復(fù)染；脫水，透明封片。顯微鏡下 觀察。免疫組織化學(xué)乂稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原 位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量 測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。免疫組織化學(xué)的方法有多種，其實(shí)都小異，不同點(diǎn)只是在于 顯色基團(tuán)！SP法1）脫蠟、水化；2）PBS洗23次各5分鐘；3）3%H：O： （80%MJ醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；4）PBS洗23次各5分鐘;5）抗原修復(fù)；6）PBS洗23次各5分鐘；7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。8）滴加I抗50 P1,室溫靜置1小時(shí)或者4C過夜

4、或者37C1小時(shí)。9）4C過夜后需在37C復(fù)溫45分鐘。10）PBS洗3次各5分鐘；11）滴加1【抗4050 P1,室溫靜置,或37C1小時(shí)；12）II 抗中可加入 0. 05%的 tween-20。13）PBS洗3次各5分鐘;14）DAB顯色510分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；15）PBS或自來水沖洗10分鐘；16）木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化：17）自來水沖洗1015分鐘；18）脫水、透明、封片、鏡檢。SABC 法1）脫蠟、水化。2）PBS洗兩次各5分鐘。3）用蒸懈水或PBS配置新鮮的3%H：0：,室溫封閉310分鐘，蒸鐳水洗3次。4）抗原修復(fù)。5）PBS洗5分鐘。6）滴加正常山羊血清封閉

5、液，室溫20分鐘。甩去多余液體。7）滴加I抗，室溫1小時(shí)或者4C過夜或者37C1小時(shí)（4C過夜后在37C復(fù)溫45分鐘）。8）PBS洗三次每次2分鐘。9）滴加生物素化二抗，20C37C20分鐘。10）PBC洗3次每次2分鐘。11）滴加試劑SABC, 20C37C20分鐘。12）PBS洗4次每次5分鐘。13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。14）蒸憎水洗。木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。15）脫水、透明、封片、鏡檢。二者區(qū)別：sp法是：一抗+生物素化二抗+HRP標(biāo)記的鏈霉卵口素（HRP標(biāo)記的親和素） 酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)(labelled avidin-biot

6、in technique,簡(jiǎn)稱LAB法)。 即用辣根過氧化物酶直接標(biāo)記avidin,用biotin標(biāo)記2抗。關(guān)鍵步驟為3步：Ag +Abl + (Ab2-B) +A*(A為HRP標(biāo)記的卵口素)A與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。如 將該法中的卵白素(avidin)變換成鏈霉卵白素(streptavidin) , LAB法即 成LsAB法，或稱SP法。據(jù)認(rèn)為L(zhǎng)AB法比ABC法敬感2、4倍，而LsAB法因streptavidin不與組織細(xì)胞中 源性生物素結(jié)合而特異性更高。現(xiàn)在SP法已趨于取代ABC法而廣為應(yīng)用。sabc法是：一抗+生物素化二抗+dbc復(fù)合物(是使用前親和素與酶聯(lián)生物素現(xiàn)

7、配使用)親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(avidin-biotin-peroxidase complex technique,簡(jiǎn)稱 ABC 法)。關(guān)鍵的程療;步驟為3步：Ag +Abl + (Ab2-B) +AB*C 復(fù)合物(Ab2-B為生物素標(biāo)記的第二抗體)(B 為生物素標(biāo)記的過氧化物酶)AB*C 復(fù)合物是avidin與酶聯(lián)biotin 1比1在使用前30min配置，混勻。1個(gè)avidin 分子結(jié)合了 3個(gè)biotin分子，剩下1個(gè)結(jié)合點(diǎn)與2抗的生物素結(jié)合，avidin起 橋聯(lián)作用。ABC法敏感性更高，比PAP法敏感2040倍，背景也更清晰。個(gè)人理解：SP法和SABC法相差不大，一般都

8、可以用.SP法：一抗+生物素標(biāo)記二抗+辣根酶標(biāo)記鏈霉卵口素+辣根酶底物顯色SABC 法：一抗+生物素標(biāo)記二抗+滴加試劑SABC （鏈霉卵白素+辣根酶標(biāo)記生物素）+辣 根酶底物顯色比較可知，SABC法SP法在原理上基本是一樣的。但由于SABC法第3步有放大 作用，所以更靈墩一些.可能會(huì)出現(xiàn)用SABC法可以做出結(jié)果的，用SP法做不出 來.總的來說，個(gè)人認(rèn)為SABC法可能好一些！我自己以及周圍的同學(xué)以前一般都 是選用SABC法！SP法1脫蠟水化2蒸佛水中5分鐘3用蒸餡水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉10分鐘蒸懈水洗1次4抗原修復(fù)5PBS洗5分鐘6滴加正常山羊血淸封閉液，室溫10分鐘7甩去多余

9、液體滴加1抗37度1小時(shí)或者4過夜4過夜后37復(fù)溫45分鐘8PBS洗2次各5分鐘9滴加生物素化抗孵育條件參見所用試劑盒10PBS11滴加酚標(biāo)抗體孵冇條件參見所用試劑盒12PBS洗2次各5分鐘13DAB顯色510分鐘在顯微鏡下掌握染色程度14蒸餡水洗終止染色木素復(fù)染鹽酸灑精分化15脫水透明封片鏡檢洗2次各5分鐘SABC 法1脫蠟水化2蒸愉水中5分鐘3用蒸餡水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉5-10分鐘蒸懈水洗1次4抗原修復(fù)5PBS洗5分鐘6滴加正常山羊血清封閉液室溫10-20分鐘甩去多余液體7滴加1抗,37度1小時(shí)或者4過夜4過夜后在37復(fù)溫30分鐘8PBS洗2次每次5分鐘9滴加生物素化二抗孵育條件參見所用試劑盒10PBC洗2次每次5分鐘11滴加試劑SABC孵冇條件參見所用試劑盒12PBS洗2次每次