椎間盤退行性疾病的生物治療策略

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減椎間盤退行性疾病的生物治療策略(作者：單位：郵編：)【關(guān)鍵詞】椎間盤退行性疾病生物1引言當(dāng)今世界，下腰痛發(fā)病率不斷增加，是人群勞動(dòng)能力喪失及下降的 重要原因，其發(fā)病高峰年齡分布在 2050歲，產(chǎn)生了嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng) 濟(jì)影響。引起下腰痛的原因較多，而絕大多數(shù)醫(yī)生和研究人員認(rèn)為 DDL是引起下腰痛的一個(gè)主要因素1。椎間盤是一個(gè)較為復(fù)雜的生 物整體，大體分為纖維環(huán) (annulus fibrosus，AF)，髓核(nucleuspulposus，NP)和終板(end-plates ，EP)。它呈現(xiàn)低細(xì)胞密度，包括 纖維環(huán)細(xì)胞、髓核細(xì)胞以及可能存在的骨祖細(xì)胞2。引起椎間

2、盤退 變的因素包括機(jī)械負(fù)荷、遺傳因素和營養(yǎng)作用等，這些因素通過影響 椎間盤細(xì)胞的活力及生物合成能力， 再加上應(yīng)力作用，促使了椎間盤 退變的發(fā)生和發(fā)展。目前DDD勺手術(shù)以及保守治療方法，能夠緩解臨床癥狀，但沒有對 椎間盤的固有功能進(jìn)行修復(fù)，因此，尋找一種更符合生理、能夠使組 織再生的方法才能從根本上解決椎間盤退變的問題。而DDD勺生物治療正是這樣一種很有潛力的治療方法。2 DDD的生物治療策略對于椎間盤退行性疾病，現(xiàn)階段主要有四類生物治療方法：向椎間 盤直接注射細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)；對椎間盤細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)基因治 療(直接基因療法)；分離同源細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，常常修飾后再重新植入； 間充質(zhì)干細(xì)胞的移植

3、。各種方法的應(yīng)用主要取決于對椎間盤細(xì)胞生物 學(xué)的現(xiàn)有認(rèn)識、椎間盤退變階段以及安全因素。2.1生物活性物質(zhì)直接注射治療活性物質(zhì)在椎間盤退變中的直接應(yīng)用通常采用直接注射的方法。對 于生長因子，細(xì)胞因子或合成代謝酶等的直接注射研究體外試驗(yàn)較體 內(nèi)試驗(yàn)開展的多。2.1.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein ， BMP)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7 ， BMP-7)也稱為 成骨蛋白-1(osteogenic protein-1 ，OP-1)，屬于 BMP家族成員。對 兔椎間盤直接注射0P-1可以顯著增加蛋白多糖合成，增加

4、椎間盤高 度3，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)0P-1甚至可以抑制大鼠退變椎間盤模型中 疼痛相關(guān)行為4。針對髓核摘除或化學(xué)融解術(shù)后出現(xiàn)的椎間隙狹窄 的問題，有學(xué)者在由軟骨素酶 ABC造成的兔椎間盤退變模型中發(fā)現(xiàn)， 注射重組人0P-1比對照組顯著改善椎間盤的高度，持續(xù)到注射后16周，同時(shí)蛋白多糖含量也顯著增加，但組織學(xué)檢測上并沒看到明顯改 善5 。此外，人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogeneticprotein-2 ，BMP-2)能在體外對老齡兔椎間盤 AF細(xì)胞產(chǎn)生積極作用， 細(xì)胞合成硫酸化氨基葡聚糖增多并分泌到基質(zhì)中，蛋白多糖和II型 膠原基因表達(dá)增加6。2.1.2 其他生物活性物質(zhì)富含血小

5、板的血漿(platelet-rich plasma, PRP在體外能輕度提高豬椎間盤細(xì)胞的增殖能力，顯著增加其合成蛋白多糖及膠原的能力， 并促進(jìn)蛋白多糖沉積。作者進(jìn)一步將PRP用明膠水凝膠微球處理注射 入退變兔椎間盤，發(fā)現(xiàn)其能減緩椎間盤退變并在 NP和內(nèi)層AF處發(fā)現(xiàn) 蛋白多糖沉積增多7、8。而重組人轉(zhuǎn)化生長因子(recombinanthuman growth differentiation factor-5， rhGDF-5)的作用在最近的動(dòng)物模型中被證實(shí)，試驗(yàn)組椎間盤較對照組在影像學(xué)、組織學(xué)及蛋白多糖含量上有明顯改善9。2.1.3 多種生物活性物質(zhì)的聯(lián)合應(yīng)用Kle in等進(jìn)行的一個(gè)臨床初期研

6、究采用一種稱為“椎間盤溶液”(disc solution)的混合物(包含基質(zhì)和輔助成分)注射到椎間盤，治療后進(jìn)行了 13個(gè)月隨訪，患者降低了殘疾評分(disability score) 和疼痛視覺模擬評分(visual analogue pain score)。作者認(rèn)為結(jié)果良好的原因可能是幾種組分的聯(lián)合注射使基質(zhì)成分平行補(bǔ)充，多種生長因子同時(shí)誘導(dǎo)椎間盤修復(fù)10。但這個(gè)實(shí)驗(yàn)并不能說明注射的組 分能維持在嚴(yán)重退變椎間盤中不漏出而產(chǎn)生持續(xù)作用。2.1.4 存在的問題直接注射療法要求椎間盤細(xì)胞數(shù)目較多且能應(yīng)答活性物質(zhì)。人椎間 盤細(xì)胞的生物合成能力及生存能力隨著退變降低，僅僅在輕度退變時(shí)這種方法才可能有

7、效，因而限制了其應(yīng)用的廣泛性，同時(shí)，通常直接注射法作用時(shí)間短，當(dāng)注射物質(zhì)耗竭或者彌散掉時(shí)作用就會(huì)停止。要解決這一問題，可以設(shè)想結(jié)合生長因子的緩釋系統(tǒng)來持續(xù)釋放活性物 質(zhì)，以獲得持續(xù)治療作用，這可能是未來的一個(gè)發(fā)展方向。另一方面， 短暫的隨訪時(shí)間得出的結(jié)論限制了其應(yīng)用于人類。2.2基因治療策略221載體的選擇通過遺傳修飾椎間盤細(xì)胞來表達(dá)所需基因產(chǎn)物，可以延長活性物質(zhì) 供應(yīng)的時(shí)間?；虻某晒?dǎo)入通常需要應(yīng)用載體輔助。載體分為病毒載體和非病毒載體。非病毒載體因?yàn)檗D(zhuǎn)染細(xì)胞成功率低、 基因表達(dá)率 低、易丟失、作用時(shí)間短而少用。但最近有學(xué)者比較研究了幾種不同 的非病毒載體對椎間盤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)LT1(M

8、irus公司生產(chǎn)并命名 的基于組蛋白的載體)有較高的轉(zhuǎn)染率和較小細(xì)胞毒性，有望成為體 內(nèi)轉(zhuǎn)染人椎間盤細(xì)胞的載體11。病毒載體是轉(zhuǎn)移基因的有效物質(zhì)，針對椎間盤細(xì)胞，應(yīng)選擇能有效 轉(zhuǎn)染非分裂期靜止細(xì)胞的病毒。1999年，Nishida等首先通過腺病毒 載體轉(zhuǎn)移有治療作用的基因轉(zhuǎn)化生長因子-B 1到椎間盤細(xì)胞取得成 功12，此后不斷有應(yīng)用腺病毒載體成功的例子，包括體內(nèi)動(dòng)物試 驗(yàn)和體外轉(zhuǎn)染人退變椎間盤細(xì)胞。為了克服腺病毒激活免疫系統(tǒng)這種 缺點(diǎn)，有學(xué)者研究了一種新的腺相關(guān)病毒載體(ade no-associatedviral vector,AAV)在退變椎間盤中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)它沒有明顯的細(xì)胞免疫并有效轉(zhuǎn)來

9、椎間盤細(xì)胞，這提示AAV可能是將來一個(gè)有價(jià)值的安 全選擇13。我國學(xué)者對重組桿狀病毒載體對椎間盤細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，證明了它能在體外和體內(nèi)有效表達(dá)搭載基因，并持續(xù)較長時(shí)間14。222 基因的選擇對用于治療的基因的篩選依然是有待研究的問題。目前研究的有治 療潛力的基因包括 TGF-B，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins , BMPs) LIM 礦化蛋白-1(LIM mineralizationprotein-1 ,LMP-1),SOX9和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue in hibitorsofmatrix metalloprote in ases,

10、 TIMP-1)等基因。LMP-l 可以使體外椎間盤細(xì)胞合成BMP和蛋白多糖增加，而在活體兔椎間盤內(nèi)注射可以提 高合成代謝細(xì)胞因子 BMP-2 BMP-7以及聚集蛋白聚糖的 mRNA水平:15。有實(shí)驗(yàn)證明聯(lián)合幾種活性物質(zhì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染，不僅有這幾種 因子在蛋白質(zhì)合成中的累加效應(yīng)而且顯示出協(xié)同作用。應(yīng)用抗分解代 謝的因子是另一種新的基因治療策略，通過抑制分解來降低基質(zhì)退 變。用腺病毒搭載TIMP-1體外導(dǎo)入分離的人退變椎間盤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) 蛋白多糖含量增高16。Zhang等研究了腺病毒攜不同BMP基因和 SOX9基因轉(zhuǎn)染牛AF和NP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對于 AF而言，攜有BMP-2及 BMP-13的腺病毒轉(zhuǎn)染后

11、蛋白糖合成增加最明顯，膠原則是BMP-13和SOX9作用最強(qiáng)；對于NP轉(zhuǎn)染BMP-2和 BMP-7最能促進(jìn)蛋白多糖合 成，而BMP-4及 BMP-14對促膠原合成作用突出。這為治療中對基因 的選擇作出了初步探索17、18。2.2.3 存在的問題椎間盤內(nèi)的低細(xì)胞密度可能會(huì)妨礙足夠數(shù)量細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，但同時(shí)這種封閉組織有助于注射的病毒載體達(dá)到高濃度，同時(shí)降低免疫反應(yīng)。 更重要的是，沒有證據(jù)顯示基因轉(zhuǎn)染效率依賴于椎間盤退變程度，這是將來可以大規(guī)模應(yīng)用這種技術(shù)的先決條件。然而，嚴(yán)重退變的椎間盤因營養(yǎng)缺乏及酸性環(huán)境，椎間盤細(xì)胞能否在有效時(shí)期內(nèi)生產(chǎn)足量生 長因子，細(xì)胞能否應(yīng)答這些因子生產(chǎn)基質(zhì)仍被質(zhì)疑。2.3同

12、源細(xì)胞的補(bǔ)充治療這種方法在于，首先分離椎間盤細(xì)胞體外進(jìn)行培養(yǎng)，允許結(jié)合生物 材料(組織工程)或者基因修飾再植入退變椎間盤。注射體外增殖的椎 間盤細(xì)胞混懸液作為最直接的同源細(xì)胞治療手段，也是迄今唯一用于臨床的方法。臨床研究中，大多數(shù)患者情況得到明顯改善，但關(guān)于移 植細(xì)胞的生存、表型以及生物合成能力的信息并不清楚19。2.3.1同源細(xì)胞結(jié)合支架最初對單層培養(yǎng)的椎間盤細(xì)胞進(jìn)行觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表現(xiàn)出一致去 分化形態(tài)學(xué)變化。但最近有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成纖維生長因子-2(fibroblastgrowth factor-2 ，F(xiàn)GF-2)能維持單層培養(yǎng)的 NP細(xì)胞的分化20。 而在三維培養(yǎng)中的椎間盤細(xì)胞通常有保守的天

13、然表型，并同天然椎間 盤類似合成基質(zhì)。以后的許多支架設(shè)計(jì)是被用來提供椎間盤細(xì)胞培養(yǎng) 的三維環(huán)境。在移植前將椎間盤細(xì)胞在三維系統(tǒng)中培養(yǎng)而不直接移植，可能會(huì)增 加細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中存活的機(jī)會(huì)。Sato等用一種支架名為 atelocollagen 結(jié)合兔AF細(xì)胞證實(shí)了這個(gè)方法21。隨后很多研究 人員將椎間盤細(xì)胞結(jié)合不同的支架諸如藻酸鹽、膠原、殼聚糖等，修復(fù)動(dòng)物退變椎間盤模型取得一定成功。最近Yang等利用纖維蛋白凝塊復(fù)合NP細(xì)胞進(jìn)行體外研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡降低，基質(zhì)中蛋白多糖 含量增加，1型膠原表達(dá)增加但 SOX9基因表達(dá)降低，提示這種支架 可誘導(dǎo)細(xì)胞纖維化分化22。232 基因修飾同源細(xì)胞這種生物治療

14、方法也可以稱為間接基因治療。毒搭載肉瘤病毒40轉(zhuǎn)染人NP細(xì)胞進(jìn)行兔退變椎間盤修復(fù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的永生細(xì)胞系能明顯 從影像學(xué)、組織學(xué)上改善椎間盤的退變，蛋白多糖及膠原RNA含量較 對照顯著增加，隨訪26周細(xì)胞存活良好并未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫作用及 致瘤風(fēng)險(xiǎn)23。而將人端粒酶導(dǎo)入體外培養(yǎng)的羊 NP細(xì)胞，其提高了 NP細(xì)胞的存活時(shí)間及增殖能力，并且持續(xù)合成細(xì)胞外基質(zhì) （I型及H 型膠原）達(dá)282 d : 24。但這個(gè)試驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)了染色體核型不穩(wěn)定， 提示安全性問題仍有待進(jìn)一步研究。2.3.3 存在的問題從椎間盤組織獲得足夠靶細(xì)胞非常困難，脫出椎間盤的細(xì)胞回收是 獲取同源細(xì)胞的有利途徑。分離髓核細(xì)胞需要打開AF

15、,植入時(shí)也會(huì)損傷AF。同源細(xì)胞移植來修復(fù)椎間盤需要在植入細(xì)胞有益作用和植 入對椎間盤結(jié)構(gòu)帶來損害之間達(dá)到精細(xì)的平衡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示注射混 懸液到兔椎間盤造成細(xì)胞從注射部位廣泛漏出，而用細(xì)胞和纖維蛋白 素原-凝血酶混合物注射時(shí)可減少漏出25。有學(xué)者研究人及豬胸椎 椎間盤纖維環(huán)在不同直徑的針注射下及受力狀態(tài)下的滲漏情況，發(fā)現(xiàn)注射入鄰近椎骨有骨質(zhì)疏松的退變椎間盤的溶液可從終板處漏出。作 者推薦用小于22號的穿刺針及小于0.2 ml的注射容積來防止漏出:26。微創(chuàng)的髓核摘除術(shù)對大多數(shù)病人效果較好，術(shù)后是否需要移 植細(xì)胞還有爭議。自體細(xì)胞移植可以用減慢椎體融合術(shù)后鄰近節(jié)段椎 間盤退變的速度，但這也對一個(gè)僅

16、有潛在退變可能的椎間盤造成影 響。而另一個(gè)有待解決的問題是：植入退變椎間盤的細(xì)胞面臨營養(yǎng)缺 乏的危險(xiǎn)，它們是否有足夠營養(yǎng)而存活較長時(shí)間并持續(xù)修復(fù)椎間盤 呢。2.4基于干細(xì)胞的治療2.4.1 干細(xì)胞的特性干細(xì)胞治療通常采用成體干細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儬幾h少，無克隆等倫理 問題，同時(shí)也較小有致瘤風(fēng)險(xiǎn)。成體干細(xì)胞在正常機(jī)體中可以更新組 織細(xì)胞，也在創(chuàng)傷修復(fù)中起作用。它們只有可塑性，能轉(zhuǎn)化為非自身 來源的組織。在骨外科，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞以及最近脂肪組織 干細(xì)胞的應(yīng)用被予以更多關(guān)注。人間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stemcells ，MSCs是未分化的多潛能干細(xì)胞，在骨骼肌、骨髓、滑膜以及真皮中

17、都有發(fā)現(xiàn)。MSCs具有高度可塑性和多向分化能力，容易獲取且相對易掌控，成為骨外科理想 的細(xì)胞及基因治療的候選者。近來研究顯示MSCs缺乏MHCI類抗原受 體，提示它的應(yīng)用具有免疫上的優(yōu)勢27。未分化狀態(tài)的干細(xì)胞需 要使其分化為軟骨細(xì)胞或者類軟骨細(xì)胞。把 MSCs!入三維系統(tǒng)中培 養(yǎng)能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為類髓核細(xì)胞表型28。將MSC同椎間盤細(xì)胞共同培 養(yǎng)將促使MSC勺椎間盤細(xì)胞表型，同時(shí) MSC將促進(jìn)椎間盤細(xì)胞的增 殖及基質(zhì)合成29。242 MSCs的應(yīng)用探索許多試驗(yàn)探索了 MSCS臺療椎間盤退變的效果。Sakai的研究，發(fā)現(xiàn) MSCs包括GFP轉(zhuǎn)染的MSCs包埋入膠原凝膠中植入兔退變椎間盤模 型中，顯示

18、出對髓核和纖維環(huán)結(jié)構(gòu)的維持作用，阻止蛋白多糖減少， 增加了椎間盤高度，植入細(xì)胞存活并表達(dá)髓核細(xì)胞特異的標(biāo)志物 20、 31。用腺病毒攜帶SOX9基因轉(zhuǎn)染MSCS結(jié)合多聚乳酸聚合物支架植 入，也取得良好結(jié)果32。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MSCS能有效阻止甚 至逆轉(zhuǎn)兔椎間盤的退變，相同劑量的 MSCs治療輕度退變椎間盤效果 較嚴(yán)重退變椎間盤好。低劑量的 MSCs（5000個(gè)）即可有效表現(xiàn)出再生 作用，而過量將產(chǎn)生有害作用。同時(shí)這項(xiàng)研究中采用的鳥氨酸加壓素 水凝膠作為MSCs的支架能幫助重建髓核含水核心及維持椎間盤的高 度:33。2.4.3 存在的問題MSCs的應(yīng)用潛力很大，但正式應(yīng)用前仍有很多問題有待解

19、決。盡管 有數(shù)據(jù)顯示分化的MSCs具有同天然髓核細(xì)胞的一致性，但并不能說 明MSCs-定分化為椎間盤細(xì)胞，而且不清楚這種表型能否長期在椎 間盤退變過程中穩(wěn)定存在。另一個(gè)問題是新合成的基質(zhì)是否具有適當(dāng) 生物力學(xué)性質(zhì)，能夠承受日常生活中的機(jī)械負(fù)荷。3討論和未來目前，生物治療DDD的臨床應(yīng)用有許多問題等待解決。譬如，椎間 盤退變病因?qū)W及細(xì)胞分子機(jī)制必須清楚，因?yàn)閮?nèi)源性致病因子的存在將致使任何治療無效或者短暫有效；髓核細(xì)胞的確切表型和特性并不 清楚，所以不能確定 MSCS能分化為髓核細(xì)胞，這將影響到基于髓核 的生物治療；細(xì)胞治療中植入細(xì)胞的營養(yǎng)問題；動(dòng)物模型同人類椎間 盤退變關(guān)聯(lián)性并不清楚，以后的研究

20、需要選用更類似于人椎間盤的動(dòng) 物模型，特別應(yīng)考慮到細(xì)胞數(shù)量、密度、機(jī)械負(fù)荷等的相似；治療同 椎間盤退變程度緊密相關(guān)，有必要對椎間盤退變分期作出定義，從而制定不同階段采用的生物治療標(biāo)準(zhǔn)。然而，隨著生物治療的發(fā)展，可 以期待這種以促進(jìn)受損組織再生恢復(fù)其功能的方法最終給患者帶來 福音?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 O Neill CW, Kurgansky ME, Derby R,et al. Disc stimulationand pattern of referred pain J . Spine,2002,27 :2776.2 Risbud, Makarand V, Guttapalli,et al. Ev

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