細(xì)胞凋亡及其調(diào)控

1、第四章 細(xì)胞凋亡及其調(diào)控,細(xì)胞凋亡的特征及意義 細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制 檢測(cè)凋亡的常用方法和技術(shù) 細(xì)胞凋亡的調(diào)控 細(xì)胞凋亡與疾病,Biochemistry arrows indicate condensed nuclear fragments.,檢測(cè)凋亡的常用形態(tài)學(xué)方法,在實(shí)際研究中，為了對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行嚴(yán)格、合理的評(píng)價(jià)，往往采用多種方法，聯(lián)合應(yīng)用。 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià) (1)普通光鏡、熒光顯微鏡觀察 分別對(duì)細(xì)胞核、質(zhì)染色，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)目 缺點(diǎn)：常受主觀因素干擾，重復(fù)性較差,(2)電子顯微鏡觀察,凋亡細(xì)胞膜表面變化，如膜發(fā)泡和某些結(jié)構(gòu)的丟失，染色質(zhì)固縮和線粒體超濃縮,necrosis,apoptos

2、is,凋亡細(xì)胞的生物化學(xué)特點(diǎn),（1）非隨機(jī)性DNA降解：細(xì)胞凋亡過程中，核酸內(nèi)切酶活化，基因組DNA被降解產(chǎn)生寡核小體片段，大小相當(dāng)于核小體（180200bp）的倍數(shù) （2）細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻：正常細(xì)胞的膜磷脂分布不對(duì)稱，氨基類磷脂如磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺多分布在膜內(nèi)側(cè)。 （3）正常的能量代謝 （4）胞漿蛋白交聯(lián)：凋亡細(xì)胞的mRNA和蛋白合成減少，誘導(dǎo)組織谷氨酰胺酶表達(dá)，在胞膜下形成殼狀結(jié)構(gòu)，使凋亡小體穩(wěn)定,3、凋亡細(xì)胞的結(jié)局,在細(xì)胞凋亡末期，破碎的核片段由一層包被，形成凋亡小體，被鄰近細(xì)胞，主要是巨噬細(xì)胞清除，不會(huì)導(dǎo)致周圍組織損傷和炎癥反應(yīng)。 壞死（necrosis）因溶酶體水解酶的

3、釋放而導(dǎo)致鄰近組織的損傷和炎癥反應(yīng),二、細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義,1、個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育 (1)胚胎發(fā)育中特定種類細(xì)胞在完成其使命后通過凋亡而淘汰，代之以新的細(xì)胞類型 指、趾、關(guān)節(jié)腔的形成，人、蝌蚪尾巴的消失 (2)成年個(gè)體中，通過細(xì)胞凋亡清除衰老細(xì)胞并代之以新生的細(xì)胞，從而維持特定組織器官的細(xì)胞類型和數(shù)量的穩(wěn)定 皮膚和粘膜等細(xì)胞的更新 （1.維持細(xì)胞總數(shù)和機(jī)體生活力 2.調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量 3.參與形態(tài)建成）,細(xì)胞凋亡在鴨和雞的腳的形態(tài)發(fā)生中的作用,細(xì)胞凋亡在非洲爪蟾發(fā)育過程中尾巴消失中的作用,溶酶體中 cathe-pasin酶的濃度,2、淋巴細(xì)胞的成熟和維持免疫系統(tǒng)的功能,在淋巴細(xì)胞的發(fā)育分化中，

4、自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆的清除 一些免疫活性細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)凋亡來殺傷靶細(xì)胞 防止過高的免疫應(yīng)答（受抗原刺激活化的T淋巴細(xì)胞自身可以通過激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程而凋亡 3、細(xì)胞凋亡與DNA和組織損傷、修復(fù)有密切聯(lián)系 細(xì)胞損傷嚴(yán)重，無法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞通過凋亡清除；組織損傷后由肉芽組織轉(zhuǎn)變?yōu)轳：圻^程,4、細(xì)胞凋亡與衰老密切相關(guān),隨著年齡的增長(zhǎng)，許多類型細(xì)胞失去凋亡能力，可能是導(dǎo)致衰老和器官功能普遍下降的原因 胸腺和淋巴細(xì)胞可能也喪失觸發(fā)凋亡信號(hào)途徑的能力 5、細(xì)胞凋亡可能與多種疾病的發(fā)生有直接聯(lián)系 腫瘤，神經(jīng)退行性疾病,4.2 Mechanisms of apoptosis,Apoptosis is tr

5、iggered by a variety of pathways,Overview of the evolutionarily conserved apoptotis pathway in C. elegans and vertebrates.,Regulators促進(jìn)或抑制凋亡，CED-9 和 Bcl-2在營養(yǎng)因子存在的情況下抑制細(xì)胞凋亡. Adapters 作用于調(diào)控蛋白和效應(yīng)蛋白;在營養(yǎng)因子存在的情況下促進(jìn)效應(yīng)蛋白的激活. 蛋白酶 caspases（胱天蛋白酶） 是胞內(nèi)一種重要的效應(yīng)蛋白;其活化可導(dǎo)致胞內(nèi)底物的降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.,一、caspase與細(xì)胞凋亡 1、caspase的種

6、類與性質(zhì) 胱天蛋白酶caspase（天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶）,活性位點(diǎn)含有QACXG（X=R，Q，C）保守氨基酸序列。 這類酶都以無活性的酶原形式合成并存儲(chǔ)在細(xì)胞中。N-端為一個(gè)序列、長(zhǎng)度特異的原結(jié)構(gòu)域，是caspase的活性調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，其后是一個(gè)大亞基和一個(gè)小亞基序列。,Caspase被活化時(shí)，在原結(jié)構(gòu)域C-端及大、小亞基間保守序列的Asp位點(diǎn)被切割，游離的大、小亞基結(jié)合成異二聚體，其活性中心由兩個(gè)亞基的部分氨基酸序列共同構(gòu)成。 caspase異二聚體可進(jìn)一步二聚化，形成活性更強(qiáng)的四聚體。,Caspase activation requires dimerization and two

7、 cleavages.,迄今共發(fā)現(xiàn)14種caspase，根據(jù)其結(jié)構(gòu)的同源性分3個(gè)亞家族： Caspase-1亞家族：caspase-1，4，5，11，12，13，14。它們的活化與炎癥因子的合成有關(guān)，多數(shù)情況下不是細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)分子。 Caspase-2亞家族：caspase-2 Caspase-3亞家族：caspase-3，6，7，8，9，10。它們都直接參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程,根據(jù)caspase前體分子(procaspase)的N-端原結(jié)構(gòu)域, 以及它們?cè)诩?xì)胞凋亡中的作用不同，caspase-3亞家族也可以分兩類： 具有”long-prodomain”的起始分子initiators，如c

8、aspase-8, 9, 10等。 可以通過這種long-prodomain與胞膜上的受體和接頭蛋白構(gòu)成的caspase激活復(fù)合物結(jié)合，結(jié)果使caspase起始分子發(fā)生聚集，并通過分子間切割而活化，繼而切割活化下游的caspase分子。,具有“short-prodomain”的效應(yīng)分子，如caspase-3, 6, 7。 它們不能相互聚集，只能作為上游caspase的底物，活化后作用于胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)或酶類，促使細(xì)胞凋亡。 (p517, 表21-2）,caspase對(duì)底物的酶切作用是高度特異的，至少可識(shí)別包括Asp在內(nèi)的4個(gè)氨基酸殘基并切割A(yù)sp后的肽鍵，該作用同時(shí)受底物空間結(jié)構(gòu)的影響。 不同的

9、caspase對(duì)其底物的氨基酸序列親和力不同，與其功能相適應(yīng)。 N- -Asp X X- X- -C 疏水 多樣化 可變，Glu最佳,Four caspase pathways involved in apoptosis Adapted from “Cytokine Bulletin”,Cell type-specific effector of apoptosis-inducing agents on caspase-9 or caspase-3 deficient mice,2、caspase的活化,在不同的細(xì)胞凋亡因素刺激下，caspase在細(xì)胞內(nèi)可以通過多種不同的途徑被活化，然后切割并

10、激活下游的caspase分子，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 （1）由死亡受體介導(dǎo)的“誘導(dǎo)接近”模型：如caspase-8，在上游分子的作用下寡聚化，然后緊密結(jié)合的caspase-8分子之間可以發(fā)生切割，釋放p18和p10至胞漿，并裝配成活性蛋白酶。這種起始活性蛋白酶將進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)蛋白酶caspase-3, -6, -7，或另一分子起始蛋白酶caspase-9。,（2） caspase-9的活化通常需要線 粒體的參與。Caspase-9在線粒 體釋放的細(xì)胞色素C和dATP存 在下，通過與Apaf-1的CARD (caspase recruitment domain) 結(jié)合成一個(gè)復(fù)合體而得以活化，然后再

11、去激活下游分子，包括caspase-3以及可能隨后被激活的caspase-2, -6, -8, -10, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 Cyt c和dATP與Apaf-1結(jié)合并誘導(dǎo)后者構(gòu)象變化，更易聚集caspase-9,效應(yīng)caspase, 如caspase-3, -6, -7, 主要通過上游caspase的切割而活化。 切割后游離的大、小亞基裝配成活化caspase。 caspase活化后的功能?,3、活化的效應(yīng)caspase誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制,細(xì)胞內(nèi)有上百種caspase的底物蛋白，如聚（ADP-核糖）多聚 酶（PARP）；DNA依賴的蛋白激酶；IkB-；蛋白激酶C、和；Rb蛋白；Ras-GTPase活化

12、蛋白；MEKK1；Akt-1和Fak等 對(duì)于其中一些底物的認(rèn)識(shí)提示，caspase可能通過以下幾種機(jī)制參與凋亡,（1）滅活細(xì)胞凋亡抑制蛋白 如caspase對(duì)ICAD/DFF45的剪切 CAD(caspase活化的DNA酶） 是一種導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生隨機(jī)性 DNA降解的特定核酸酶。非凋亡期，CAD和ICAD（inhobitor of CAD）結(jié)合形成無活性復(fù)合物 細(xì)胞凋亡時(shí)，caspase剪切ICAD使其失活，CAD從而游離并進(jìn)入細(xì)胞核，降解DNA。 DFF：HeLa細(xì)胞中分離的DNA片段化因子，ICAD同源分子,（2）剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白,如caspase對(duì)核板的降解作用 核板是襯托于核內(nèi)膜表面的堅(jiān)固

13、結(jié)構(gòu)，與染色質(zhì)的組織密切相關(guān)。它由核纖層蛋白的頭尾多聚體組成。 細(xì)胞凋亡過程中，caspase在單一位點(diǎn)剪切核纖層蛋白，導(dǎo)致核板塌陷和染色質(zhì)濃縮。 Caspase剪切的還有肌動(dòng)蛋白，F(xiàn)ak和核分裂相關(guān)蛋白等。,（3）剪切核效應(yīng)蛋白,Caspase可能作用于DNA修復(fù)、mRNA拼接和DNA修復(fù)相關(guān)蛋白，使其活性喪失或失調(diào)。 聚（ADP-核糖）多聚 酶（PARP）與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)； 細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，PARP被剪切，導(dǎo)致其氨基端的兩個(gè)結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化結(jié)構(gòu)域分離，進(jìn)而喪失其正常功能。,4、caspase活化的抑制劑,細(xì)胞內(nèi)存在一些caspase的抑制蛋白，防止casp

14、ase的非特異性活化。一些病毒蛋白或人工小肽也可以抑制caspase （1）IAP(inhibotors of proteins)家族 可以通過與死亡受體復(fù)合物上的TRAF結(jié)合而阻止細(xì)胞凋亡 （2）一些caspase的底物 如IL-1以及一些人工小肽，是caspase的抑制劑,（3）一些能阻斷l(xiāng)ong-prodomain相互 作用的物質(zhì) 如sentrin能特異性結(jié)合Fas，卻不能結(jié)合FADD，從而阻斷了caspase-8的活化 （4）絲氨酸蛋白酶抑制劑 如昆蟲病毒蛋白p35, 牛痘病毒蛋白CrmA等，都能抑制caspase的活性 （5）FLIPs家族 在病毒中發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制劑，結(jié)構(gòu)域中含有DE

15、D，與FADD或caspase-8競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合而發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用,5、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的其它酶類,核酸內(nèi)切酶: 多數(shù)作為caspase的底物而被活化并發(fā)揮作用，在核小體連接處切割染色體 蛋白激酶：一些與caspase相互作用影響細(xì)胞凋亡的蛋白激酶，如PKC，DNA-PKcs（DNA-依賴性蛋白激酶，一種哺乳動(dòng)物絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與損傷DNA的修復(fù)、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的完整性，可被caspase-3催化而滅活）,總之，caspase是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵分子群，其活化是不同凋亡途徑中共同的下游事件。 活化的caspase通過切斷與周圍細(xì)胞的聯(lián)絡(luò)、重組細(xì)胞估價(jià)、阻止DNA復(fù)制和修復(fù)、破壞DNA和核結(jié)構(gòu)、誘

16、導(dǎo)凋亡小體的形成等，在細(xì)胞凋亡中起重要作用。,Key Concepts,靶細(xì)胞表面的Fas受體與作用細(xì)胞質(zhì)膜表面的FasL（配體）相互結(jié)合，從而被激活. Fas 和TNF（腫瘤壞死因子）受體相關(guān), FasL 類似 TNF. Fas與FasL結(jié)合后聚集成為三聚體結(jié)構(gòu). Fas受體胞漿區(qū)結(jié)構(gòu)域即“死亡受體”， 作用是與其它蛋白質(zhì)相互作用。,二、死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,1、死亡受體的結(jié)構(gòu) 細(xì)胞表面有一類能結(jié)合細(xì)胞間凋亡刺激分子，并將信號(hào)傳導(dǎo)至胞內(nèi)引起凋亡的受體，稱“死亡受體”(death receptor, DR) 。 屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。,Topology structure

17、of DR,TNFR結(jié)構(gòu)上包括： 一個(gè)由1-6個(gè)富含Cys結(jié)構(gòu)域構(gòu) 成的保守的胞外區(qū)， 一個(gè)60 80 個(gè)氨基酸組成的 “死亡結(jié)構(gòu)域”(death domain, DD)的胞內(nèi)區(qū) Fas/FasL信號(hào)途徑中，還含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（death effector domain, DED)。該結(jié)構(gòu)域同時(shí)存在于起始caspase分子中。,2、死亡受體介導(dǎo)凋亡的途徑,通常FasL分子以同三聚體形式和3個(gè) Fas分子交聯(lián)，導(dǎo)致Fas的死亡結(jié)構(gòu)域 DD成簇，并以DD為中介結(jié)合FADD， 形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC）。 隨后，F(xiàn)ADD通過其DED結(jié)構(gòu)域和caspase-8的DED相互作用，導(dǎo)致caspa

18、se-8形成寡聚體，并驅(qū)使其自身活化 活化的caspase-8進(jìn)一步活化效應(yīng)caspase, 如caspase-3等，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。,TNF與其受體TNFR結(jié)合后， （1）能夠活化轉(zhuǎn)錄因子NF-B 和AP-1，誘導(dǎo)促炎癥和免疫調(diào)節(jié)基因表達(dá) （2）通過與Fas L 相同途徑誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡,通過對(duì)小鼠突變基因lpr的研究證實(shí)了這一凋亡信號(hào)通路. 該基因是Fas的隱性突變, 導(dǎo)致胸腺淋巴細(xì)胞增生,引起B(yǎng)細(xì)胞、T細(xì)胞免疫失衡. 另一具有類似作用的突變是gld (產(chǎn)生淋巴肉瘤疾病， lymphoproliferative disease). 證明該基因編碼FasL.,The related prope

19、rties of these two loci suggest that this apoptotic pathway is triggered by an interaction between the FasL ligand (gld product) and Fas (lpr product). 該通路對(duì)淋巴細(xì)胞的成熟至關(guān)重要,Mitochondria and Bcl-2 families are involved in Fas-induced apoptosis,三、線粒體與細(xì)胞凋亡（ Apoptosis involves mitochondrial events ）,Changes

20、in mitochondria occur during apoptosis (and also during other forms of cell death) . These are typically detected by changes in permeability(線粒體通透性）. The breakthrough in understanding the role of mitochondria was the discovery that cytochrome c is released into the cytosol （細(xì)胞色素c釋放）,1、細(xì)胞凋亡過程中線粒體跨膜電位

21、的變化 線粒體內(nèi)膜通透性小，存在一些載體蛋白和質(zhì)子泵，能有效地將線粒體基質(zhì)內(nèi)的質(zhì)子泵入外室，形成內(nèi)負(fù)外正的線粒體跨膜電位。 幾乎所有誘導(dǎo)劑引起各種細(xì)胞凋亡時(shí)都伴隨有線粒體跨膜電位的下降，并且這種變化發(fā)生在凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)改變之前。 線粒體跨膜電位的部分維持依賴于線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPT）。,生理?xiàng)l件下，MPT呈周期性開放，使線粒體外室的質(zhì)子進(jìn)入基質(zhì)，從而防止質(zhì)子在外室的過度蓄積。 MPT的持續(xù)開放或關(guān)閉則分別誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞凋亡。幾乎所有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素都可以造成MPT的破壞，如GSH耗竭劑、caspase-1等。 MPT的持續(xù)開放將產(chǎn)生致死性后果，如跨膜電位和呼吸鏈脫偶聯(lián)、GS

22、H耗竭、ROS產(chǎn)生、基質(zhì)Ca2+外流和線粒體膜間蛋白的釋放等。 這些因素進(jìn)一步導(dǎo)致MPT的開放和跨膜電位的破壞,Mitochondrial damage affairs,2、線粒體釋放的凋亡誘導(dǎo)分子,The mitochondrion plays a central role in apoptosis by releasing cytochrome c. This is activated by BID. It is inactivated by Bcl-2. Cytochrome c binds to Apaf-1 and (pro)-Caspase-9 to form the apopto

23、some.,在Bax過表達(dá)、UV照射、氧化劑、神經(jīng)酰胺等因素的作用下，線粒體MPT開放，外膜破壞并釋放Cyt C等凋亡相關(guān)分子，是介導(dǎo)線粒體凋亡途徑中的重要效應(yīng)分子。,caspase-9 (and other caspases)的蛋白水解酶活性 可被 IAP 家族抑制.線粒體可釋放IAP蛋白家族的拮抗分子.,（1）Cyt C： 被釋放至胞質(zhì)的Cyt C在ATP或dATP的輔助下可特異性結(jié)合胞漿接頭蛋白Apaf-1并促進(jìn)Apaf-1寡聚化，Apaf-1借其N-端CARD直接募集多個(gè) caspase-9分子，形成 “apotosome”,變構(gòu)并活化 caspase-9.,活化的caspase-9再

24、激活下游分子，包括caspase-3及可能隨后被激活的caspase-2, -6, -8, -10。,Cyt C還是線粒體呼吸鏈的重要組成成分，Cyt C的耗竭可能導(dǎo)致呼吸鏈中電子傳遞的破壞使ATP生成受阻和ROS產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。 Cyt C釋放誘導(dǎo)凋亡還是壞死取決于細(xì)胞類型：Cyt C充足的細(xì)胞，仍然有足夠的Cyt C維持電子轉(zhuǎn)運(yùn)，氧消耗和ATP聲稱2保持正常水平凋亡 反之，在含有大量caspase抑制劑的細(xì)胞，Cyt C的釋放不能誘導(dǎo)caspase依賴的細(xì)胞凋亡，MPT的破壞則誘導(dǎo)壞死,Antiapoptotic signalling by the PI3-kinase/Akt k

25、inase pathway,(2)Smac (second mitochondria-derived activator of caspase),線粒體釋放的caspase活化蛋白，MW 25 kD，N-端具有線粒體定位信號(hào)。 Smac從線粒體釋放后，與caspase活性抑制蛋白IAPs家族分子結(jié)合，從而解除IAPs對(duì)caspase的抑制。 Smac在p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中起重要的促進(jìn)作用，而Bcl-2、Bax則分別通過抑制和促進(jìn)Smac的釋放對(duì)細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用。,（3）凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor, AIF）,1996年發(fā)現(xiàn)，存在廣譜caspas

26、e抑制劑是，鼠肝細(xì)胞線粒體膜間隙組分仍有促凋亡活性，分離鑒定出AIF。 AIF可直接進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致染色體濃縮、斷裂，作用不依賴于caspase。 （4）Endo G（endonuclease G） MW 30 kD, 是一種可以切斷DNA的caspase非依賴性核酸酶，進(jìn)化上保守，在細(xì)胞凋亡中可導(dǎo)致DNA斷裂和染色質(zhì)濃縮。,四、There are multiple apoptosis pathways,（一）細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)途徑 以p53為中心的核凋亡通路及其轉(zhuǎn)換機(jī)制在細(xì)胞凋亡的誘發(fā)中具有重要作用。 當(dāng)細(xì)胞面臨DNA損傷、紡錘絲斷裂、癌基因異常激活、缺氧等不利因素時(shí)，在上游信號(hào)分子的作用下，p

27、53表達(dá)上調(diào)，一方面通過與p16, p21以及Rb等相互作用引起細(xì)胞周期阻滯，另一方面通過促進(jìn)bax, fas等基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。,（二）粒酶(Granzyme)B介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制之一是誘發(fā)細(xì)胞凋亡，這種凋亡 的作用主要是由它們分泌的粒酶B實(shí)現(xiàn)的。 1、粒酶B（GrB）的基本結(jié)構(gòu)與功能 粒酶是CTL和NK細(xì)胞殺傷性顆粒中絲氨酸蛋白酶家族的總稱。以酶原形式合成，接受胞內(nèi)外信號(hào)刺激后被激活。 人類有5種：GrA、GrB、GrH、GrM和類胰蛋白酶-2 粒酶的重要功能是參與顆粒介導(dǎo)的殺傷過程，酶切靶細(xì)胞內(nèi)多種底物蛋白，有效啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。,Properties

28、of granzymes in humans and rodents Granzyme Species Activity Predicted cleavage Mr(kD) Cellular expression A Mo, H, Rt Tryptase Lysine, arginine 65* CTLs, NK cells, T cells and thymocytes B Mo, H, Rt Asp-ase Asp Glu 32 CTLs, NK cells, T cells and thymocytes C Mo, Rt Unknown Asp or Ser 27 CTLs D Mous

29、e Unknown Hydrophobic 35-50 CTLs E Mouse Unknown Hydrophobic 35-45 CTLs F Mo, Rt Unknown Hydrophobic 35-50 CTLs G Mouse Unknown Hydrophobic 30 CTLs H Human Chymase Phen Tyr 32 CTLs and NK cells J Rat Unknown Unknown 30 Unknown M Mo, H, Rt Met-ase Met Leu 30 NK cells,JA Trapani, Genome Biology 2001,

30、2(12):reviews3014.13014.7,GrB活性中心由3個(gè)氨基酸組成：His44，Asp88，Ser183，其中Ser是發(fā)揮催化活性的關(guān)鍵殘基。 GrB與其它幾種粒酶及穿孔素(perforin, PFN)等一起貯存于CTL的殺傷性顆粒中。 其N-端帶有一個(gè)酸性二肽，必須經(jīng)顆粒中的二肽?；拿?加工除去，才能產(chǎn)生活性GrB。 GrB活性受嚴(yán)格調(diào)控。（酶原形式，環(huán)境pH）。,2、粒酶B進(jìn)入靶細(xì)胞的途徑,當(dāng)CTL識(shí)別靶細(xì)胞時(shí)，殺傷性顆粒迅速移向與靶細(xì)胞接觸的位置-極化現(xiàn)象。發(fā)生脫顆粒，使其中的GrB等釋放，接著進(jìn)入靶細(xì)胞。進(jìn)入途徑有： PFN孔道模型：PFN在中性pH和Ca2+參與下，

31、12-18個(gè)PFN形成直徑1518nm的多聚復(fù)合體孔道，將GrB運(yùn)輸入胞。,GrB內(nèi)吞模型：GrB是通過靶細(xì)胞膜表面受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用，進(jìn)入靶細(xì)胞的內(nèi)吞小體中。陽離子非依賴型6-磷酸甘露糖受體是GrB的死亡受體。 PFN的主要功能是促使GrB從內(nèi)吞小體中釋放，進(jìn)一步定位到細(xì)胞核與細(xì)胞漿，特異切割底物。,3、粒酶B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑,（1）caspase依賴的死亡通路 GrB可以切割激活多種caspase前體。此外，GrB還可以直接切割caspase下游底物，如PARP, DFF45, Bid等，進(jìn)一步放大caspase的作用。,（2）GrB介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑,GrB高效切割Bid，產(chǎn)生截短型B

32、id轉(zhuǎn)位至線粒體，并募集Bax嵌入線粒體膜，誘導(dǎo)線粒體釋放Cyt C、Smac/Diablo等多種促凋亡分子。 GrB誘導(dǎo)線粒體開啟膜通透性孔道PTP和破壞跨膜電位，直接損傷線粒體功能。 GrB還能使線粒體去極化，直接引起細(xì)胞死亡。這一過程需要胞內(nèi)因子參與。,（3）GrB還可以直接切割DFF45使之失活，釋放出核酸酶CAD，引起細(xì)胞核DNA片段化；GrB還可以直接遷移至核內(nèi)，切割核蛋白，啟動(dòng)回促進(jìn)核凋亡。 在GrB誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過程中，caspase依賴性途徑和線粒體途徑占主導(dǎo)地位，其它途徑的作用相對(duì)較弱。但各途徑之間也是相互協(xié)同、相互補(bǔ)充的。 當(dāng)病毒或腫瘤細(xì)胞干擾、破壞主要途徑，逃避宿主免疫監(jiān)

33、視時(shí)，次要途徑就發(fā)揮重要作用，清除異常細(xì)胞。,A schematic model of GrB mediated apoptosis,Putative extracellular (perforin-independent) roles for GrB in age-related chronic inflammatory disorders,Laboratory Investigation (2009) 89, 11951220,（三）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)途徑,Caspase-12前體分子主要定位在ER膜表面，可能與ER介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān) 鈣離子通道劑A23187等作用下，ER表面的casp

34、ase-12被calpain剪切活化并釋放到胞漿中，引起PC12等細(xì)胞凋亡。,(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)成熟和折疊的破壞導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷從而引發(fā)細(xì)胞凋亡; (2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡蛋白酶caspase-12的激活;(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣信號(hào)的異常(Breckenridge et al。2003)。 (3) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上也存在Bak等凋亡蛋白，在凋亡因子的刺激下，Bax也能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上富聚，Bax和Bak的多聚化和caspase12的激活可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,Hu et al. J Biochem Mol Biol. 2005, 38(6):709-716 Tan et al. JBC 2006, Apr 5, epub ahea

35、d,（四）細(xì)胞的脫落凋亡（anoikis） 細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有重要作用，如果失去基質(zhì)的支持，細(xì)胞會(huì)發(fā)生程序性死亡，稱脫落凋亡。 整合素家族介導(dǎo)的相關(guān)蛋白激酶途徑 起重要作用。包括FAK，PTK， PI-3K/Akt，MAPK，SAPK/JNK等。,Model for FAK-NT induced rounding and apoptosis in breast cancer cell lines,HIEC cells selectively express PI3-K isoform complexes, translating into distinct roles

36、in Akt-1 activation and cell survival, as well as in a selective engagement by Fak and/or Src within the context of b1 integrin/Fak/Src-mediated suppression of anoikis,Apoptosis (2012) 17:566578,(五）necroptosis（necrosis + apoptosis，壞死狀凋亡）,缺乏凋亡條件(如FasL, TNF等)的情況下，利用RIPK1激酶促發(fā)細(xì)胞壞死狀凋亡,Aponecrosis 凋亡樣壞死,指

37、一類凋亡和壞死的混合形式。許多細(xì)胞毒性物質(zhì)會(huì)在低濃度誘導(dǎo)PCD，在高濃度引起細(xì)胞壞死。假設(shè)細(xì)胞程序性死亡發(fā)生前細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過程已經(jīng)受損，可以解釋該現(xiàn)象。事實(shí)上，這是細(xì)胞毒性最常見的模式，從過氧化氫和其他氧化物到線粒體毒性物質(zhì)antimycin A。 Nicotera，Lipton和他們的同事證明了谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，可能通過凋亡或壞死,依賴于線粒體膜電位改變和細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)。然而，在大多數(shù)情況下，與壞死樣形態(tài)學(xué)改變有關(guān)的aponecrosis并未證明是程序化的。,Apoptotic and necrotic hepatocellular death in response to stres

38、s signals,Journal of Reproductive Medicine and Endocrinology 2006; 3 (2): 103-108,4.3 檢測(cè)凋亡的常用方法和技術(shù),一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià) 1、普通光鏡、熒光顯微鏡觀察 分別對(duì)細(xì)胞核、質(zhì)染色，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)目 缺點(diǎn)：常受主觀因素干擾，重復(fù)性較差,2、電子顯微鏡觀察,凋亡細(xì)胞膜表面變化，如膜發(fā)泡和某些結(jié)構(gòu)的丟失，染色質(zhì)固縮和線粒體超濃縮 用于定性研究, 不適于定量,necrosis,apoptosis,二、質(zhì)膜完整性的評(píng)價(jià)檢測(cè),（一）細(xì)胞膜及核膜完整性的檢測(cè) 1、膜通透性檢測(cè) （1）拒染實(shí)驗(yàn) 臺(tái)盼藍(lán)、碘化丙啶（PI）

39、、EB等為膜不通透染料，可使壞死細(xì)胞或凋亡后期繼發(fā)性壞死細(xì)胞核著色，而活細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不著色。 缺點(diǎn)：不能區(qū)別繼發(fā)性壞死和真正意義上的壞死細(xì)胞；且易低估細(xì)胞死亡的程度，因?yàn)樵缙诘蛲黾?xì)胞還具有完整的細(xì)胞膜而被錯(cuò)誤地當(dāng)作活細(xì)胞。,（2）濃染實(shí)驗(yàn) Hoechst 33342、33258等為膜通透性染料，可之凋亡細(xì)胞著色濃密，區(qū)別正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。 （3）雙重染色 采用對(duì)正常細(xì)胞膜和凋亡細(xì)胞跨膜通透性不同的兩種染料同時(shí)染色來區(qū)別 常用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡對(duì)丫啶橙（AO）和EB的雙重染色的細(xì)胞進(jìn)行分析。 正常細(xì)胞AO染色呈綠色；凋亡細(xì)胞AO陽性，EB陽性紅染。,2、Annexin V的檢測(cè),一種通過

40、檢測(cè)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變來區(qū)分活細(xì)胞、凋亡或壞死細(xì)胞的方法。凋亡細(xì)胞膜磷脂不對(duì)稱，膜內(nèi)磷脂酰絲氨酸外翻，與連接素（Annexin）V有較強(qiáng)的親和力。 因此熒光標(biāo)記的Annexin V可以作為一種敏感探針來檢測(cè)細(xì)胞凋亡 同時(shí)使用膜不通透性染料PI能將凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞區(qū)別,FCM detecting of Annexin V-conjugated cells,（二）線粒體等細(xì)胞器膜完整性的檢測(cè),通過檢測(cè)線粒體跨膜電位的改變，來檢測(cè)線粒體膜完整性 一些帶有正電荷、并具有膜通透性和親脂性的熒光染料均能被活細(xì)胞攝取并堆積在線粒體中。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生后，線粒體跨膜電位降低，染料減少，可借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)。,The

41、 fluorescent indicator provided aggregates in the mitochondria. healthy cells - red fluorescence. apoptotic cells - green fluorescence.,三、DNA斷裂的檢測(cè),1、DNA ladder 細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察

42、到典型的DNA ladder。,細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖 1細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0 h 2細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1 h 3細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2 h 4細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3 h 5細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4 h 6陰性對(duì)照 7Marker （ 自趙允、翟中和）,“DNA ladder”被作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的生化指標(biāo)。 缺點(diǎn)：此方法敏感性不高，大量凋亡細(xì)胞同時(shí)存在時(shí)才出現(xiàn)典型的結(jié)果，且只能被用于細(xì)胞群體，不能用于組織的原位檢測(cè)。,2、DNA凋亡峰的檢測(cè),凋亡細(xì)胞在固定和清洗中，易發(fā)生小分子量DNA流失，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA含量減少 應(yīng)用DNA特異性熒光染料（PI，DAPI，Hoechst）染色后，在流式細(xì)胞儀進(jìn)行的細(xì)

43、胞周期分析中，凋亡細(xì)胞常以亞二倍體形式出現(xiàn),3、TUNEL技術(shù),原理:細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。,優(yōu)點(diǎn),未端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）使核苷酸在雙鏈的斷端延伸，不需要模板的存在 由

44、于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征 可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。,缺點(diǎn),值得注意的是壞死期由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶和蛋白質(zhì)酶的等作用，DNA被切割成大小不等的片段，?？沙霈F(xiàn) 陽性反應(yīng)；組織或細(xì)胞處理不當(dāng)時(shí)也可出現(xiàn)假陽性。因而，TUNEL等方法對(duì)凋亡細(xì)胞的標(biāo)記是選擇性的,而不是特異性的。 TU

45、NEL或其他DNA裂解原位標(biāo)記的分析應(yīng)結(jié)合陽性細(xì)胞的形態(tài)，尤其是核的特征，細(xì)胞的分布和有無炎癥反應(yīng)，以排除非凋亡的陽性反應(yīng)。,四、生化指標(biāo),Caspase 3的活化,細(xì)胞色素c的釋放,Bcl-2的表達(dá)和磷酸化,Fas和FasL 的表達(dá),4.4 細(xì)胞凋亡的調(diào)控,一、細(xì)胞自身蛋白的調(diào)控作用 1、p53的調(diào)控作用 p53的基本結(jié)構(gòu)：野生型p53蛋白為一393 AA的轉(zhuǎn)錄因子，活性形式為四聚體，自N-端為：轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、四聚體化區(qū)及C-端調(diào)節(jié)區(qū)。 p53 C-端易被降解或發(fā)生磷酸化修飾,AA324-355對(duì)p53蛋白的四聚化是必需的，使之首先形成2個(gè)各由2個(gè)-折疊和2個(gè)-螺旋構(gòu)成的二聚體，

46、兩個(gè)二聚體通過疏水作用連接成一個(gè)四螺旋結(jié)構(gòu),P53的表達(dá)及活性調(diào)節(jié) 細(xì)胞中DNA損傷，紡錘絲斷裂，癌基因異常激活，缺氧，以及ATP耗竭等信號(hào)都能導(dǎo)致p53水平的迅速升高和p53蛋白活化。（蛋白半衰期延長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄上調(diào)） 已發(fā)現(xiàn)幾種探測(cè)DNA損傷的“分子探測(cè)器”ATM、DNA-PKcs、ATR等，可以將DNA損傷或脅迫信號(hào)傳遞給p53, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。,正常細(xì)胞中p53的含量和活性是受到嚴(yán)密監(jiān)控的。 HDM2（human double minute-2)是p53的最主要的負(fù)反饋分子，介導(dǎo)p53的胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)和泛素化降解；JNK也可以結(jié)合p53并介導(dǎo)其泛素化降解 細(xì)胞受到刺激時(shí)，眾多激酶可以對(duì)p53分子的

47、不同位點(diǎn)進(jìn)行多種修飾，進(jìn)而發(fā)揮不同功能。 如p53的Ser15, Thr8, Ser20等被磷酸化后，HDM2不能與p53結(jié)合阻止降解；某些激酶磷酸化HDM2的p53結(jié)合位點(diǎn)，使其失去結(jié)合能力,p14蛋白與HDM2結(jié)合，抑制HDM2的E3泛素連接酶活性，使p53免于降解,Regulation of p53 protein,p53對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用 細(xì)胞可以經(jīng)過以p53為核心的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行基因修復(fù)、引起細(xì)胞周期阻滯、或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 p53主要作用于細(xì)胞周期的G1期、G2/M期、G0-G1-S-Rb等檢查點(diǎn)，并引起細(xì)胞周期停滯。 G1/S期調(diào)節(jié)點(diǎn)是p16-cyclinD1-CDK4

48、-Rb途徑，p16是cyclinD1-CDK4的負(fù)調(diào)節(jié)因子，Rb是cyclinD1-CDK4的主要靶蛋白，通過作用于E2F-DP轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期必需基因。,p53可以通過促進(jìn)細(xì)胞周期抑制蛋白p21作用于p16、Rb等信號(hào)途徑，抑制cyclin-CDK復(fù)合體，如cyclinD-CDK4, cyclinE-CDK2等的活性，,接著Rb去磷酸化，結(jié)合E2F并抑制E2F家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，引起細(xì)胞周期停滯在G1期。,細(xì)胞周期在G1、G2/M期的停滯為DNA修復(fù)提供了時(shí)間，一旦修復(fù)失敗，p53則在其它因素的配合下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。,2、Bcl-2家族蛋白的調(diào)控作用 Bcl-2是迄今研究最深入、

49、廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。 哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)至少15個(gè)Bcl-2同源蛋白： 凋亡抑制蛋白：Bcl-2, Bcl-XL, A1/Bf-1, Bcl-W, Mcl-1等 凋亡誘導(dǎo)蛋白：Bax, Bcl-Xs, Bad, Bik, Bak, Bid, Hrk等,（1）Bcl-2家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與功能的關(guān)系,包含兩大結(jié)構(gòu)域：C-端的跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane region, TM); 數(shù)量不等的Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(Bcl-2 homology, BH)。 按結(jié)構(gòu)分Bcl-2, Bax, BH3家族,Bcl-2是一種細(xì)胞內(nèi)膜蛋白，主要定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜。TM結(jié)構(gòu)域（信號(hào)錨定序列）是

50、Bcl-2定位所必需的。 BH結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)與其它分子間相互作用的重要功能區(qū)。 多數(shù)Bcl-2家族蛋白能形成二聚體（通過BH結(jié)構(gòu)域）。促進(jìn)存活和促進(jìn)凋亡的成員間也可以借助于BH形成二聚體，影響彼此功能,（2）Bcl-2家族蛋白對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用,Bcl-2亞家族，如Bcl-XL能通過BH4結(jié)合Apaf-1，阻止后者對(duì)caspase-9的活化；而BH3亞家族，如Bik，則與Bcl-XL結(jié)合而抑制上述活性。 由于含有BH1、BH2，Bcl-2和Bax可以在細(xì)胞器膜上形成性質(zhì)不同的孔道，從而保護(hù)或破壞該細(xì)胞器。 如Bcl-2、 Bcl-XL能抑制線粒體PTP開放和維持跨膜電位；相反，Bcl-Xs則阻止B

51、cl-XL和Cyt C結(jié)合。 Bcl-2家族蛋白自身活性也受調(diào)節(jié)蛋白磷酸化,Proposed intracellular pathways leading to cell death by apoptosis or to trophic factormediated cell survival in mammalian cells.,3 、 IAP(inhibitor of apoptosis proteins)家族蛋白的調(diào)控作用,IAP是一類發(fā)現(xiàn)于桿狀病毒中的細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族。在人類中已發(fā)現(xiàn)6個(gè)成員：NIAP，c-IAP1，c-IAP-2，XIAP， Survivin，BRUCE。 IA

52、P一級(jí)結(jié)構(gòu)中N-端為桿狀病毒IAP重復(fù)序列BIR，BIR的C-端包含CX2CX16HX6C保守序列，IAP分子可串聯(lián)2-3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)，但只有含BIR2才有活性。 IAP的C-端是一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，與IAP分子的調(diào)節(jié)功能有關(guān)。,IAP抑制細(xì)胞凋亡： 直接抑制caspase的活化caspase-3, 7, 9）,作用于TNFR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(降解I-B引起NF-B 活化，抑制凋亡的發(fā)生),二、病毒蛋白的調(diào)控作用,1、病毒的Bcl-2同源蛋白 腺病毒編碼的EIA有雙重功效：激活靜息期細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期；而在細(xì)胞增殖受阻時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 EIA表達(dá)的結(jié)果依賴于細(xì)胞中p53. E1B-19kD類似于Bcl-2，抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 LMP、BHRF1等促進(jìn)細(xì)胞存活,2、caspase活化抑制蛋白 如IAP家族等 3、HIV感染介導(dǎo)的細(xì)胞 凋亡 HIV外殼蛋白誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡 通過Fas/FasL途徑,三、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡調(diào)控,在生物體中細(xì)胞的增殖和死亡是密切相關(guān)，受到精細(xì)調(diào)控的過程，二者共同維持特定器官和組織的平衡和細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定。 細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控 G1期p53，Rb，E2F S，G2/MBcl-2，p53,Cell cycle were regulated by CDK complexes,4.5 細(xì)胞凋亡與疾病,一、細(xì)胞凋亡異常與疾病的發(fā)生 多