單克隆抗體制備方法

1、單克隆抗體制備方法1975年分子生物學(xué)家 G.J.F克勒和C米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上， 創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)抗 原免疫后的純系小鼠B細胞融合，成為雜交細胞系，既具有瘤細胞易于在體外無限增殖的特性，又具有抗體形成細胞的合成和分泌特異性抗體的特點。將這 種雜交瘤作單個細胞培養(yǎng)，可形成單細胞系，即單克隆。利用培養(yǎng)或小鼠腹腔 接種的方法，便能得到大量的、高濃度的、非常均一的抗體，其結(jié)構(gòu)、氨基酸 順序、特異性等都是一致的，而且在培養(yǎng)過程中，只要沒有變異，不同時間所 分泌的抗體都能保持同樣的結(jié)構(gòu)與機能。這種單克隆抗體是用其他方法所不能得到的。這項新技術(shù)從

2、根本上解決了在抗體制備中長期存在的特異性和可重復(fù)性 問題，可用于探討 蛋白質(zhì)的精細結(jié)構(gòu)； 淋巴細胞亞群的表面新抗原； 組織相容性抗原； 激素和藥物的放射免疫（或酶免疫）分析； 腫瘤的定位和分類； 純化微生物和寄生蟲抗原； 免疫治療和與藥物結(jié)合的免疫-化學(xué)療法（“導(dǎo)彈”療法利用單克隆抗體與靶細胞特異性結(jié)合，將藥物帶至病灶部位。因此，單克隆抗體可直接用于人類疾病的診斷、預(yù)防、治療以及免疫機制的研究，為人類惡性腫瘤的免疫診斷與免 疫治療開辟了廣闊前景。單克隆抗體是由單一 B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、 僅針對某一特定抗原表位的抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤（hybridoma ）抗體技術(shù)是在細胞

3、融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏 B細胞和具有無限 繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為 B細胞雜交瘤。用具備這種特性的單個雜父瘤細胞培養(yǎng)成細胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。單克隆抗體是人工制備的雜交瘤細胞生產(chǎn)的，雜交瘤細胞是由一個經(jīng)抗原激活后的B細胞與一個骨髓瘤細胞融合形成。單克隆抗體優(yōu)點：純度高，靈敏 度高，特異性強，交叉反應(yīng)少，制備的成本低。缺點：對技術(shù)有一定的要求， 而且通過抗原的化學(xué)處理很容易丟失表位。一、單克隆抗體制備過程1. 免疫動物免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的 過程。一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預(yù)先制定的免

4、疫方案進行免疫注射。抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。2. 細胞融合采用二氧化碳氣體處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融 合，形成雜交瘤細胞。3. 選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌

5、呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶， 并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。4. 雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體 的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞 的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。5.

6、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。（1）體內(nèi)誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。（2）體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤 細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細胞及其碎片，即可 獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。各種新型培養(yǎng)技術(shù) 和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。二、單克隆抗體抗原準備抗

7、原，是指能夠刺激機體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體 和致敏淋巴細胞在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)?？乖幕咎匦杂袃煞N，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是抗原性。很多物質(zhì)都可以成為抗原，抗原的具體分類可以參見抗原，在進行單克隆抗體制備過程中，很多物質(zhì)都可以成為抗原，在常規(guī)的科研實驗中，科研者經(jīng)常選用每只小鼠/大鼠每次注射1050ug重組蛋白、偶聯(lián)多肽、偶聯(lián)小分子等作為 抗原產(chǎn)生特異性的單克隆抗體。1動物免疫單克隆抗體制備的宿主動物一般選用BALB/c小鼠，鼠單抗的應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛，一些國內(nèi)外公司均開發(fā)出了兔的單克隆抗體制備

8、技術(shù)。免疫原分為可溶性抗原和顆粒性（細胞）抗原，用無菌鹽水稀釋并與佐劑混合，腹腔注射抗原與佐劑徹底混勻后形成的穩(wěn)定乳狀液，在免疫原提供持續(xù)的免疫應(yīng)答基礎(chǔ)上進行加強免疫2. 細胞融合細胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學(xué)融合法和生物融合法， 如滅活的仙臺病毒，此處例舉化學(xué)融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二 醇（PEG），在分子量為 200700時，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大 于1000時，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機溶劑，對熱 穩(wěn)定，與許多化學(xué)藥品不起作用。用作細胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量 為4000者，常用濃度為 50%, pH8.0pH8.2 （

9、用10%NaHCO3調(diào)整），分子量 小的PEG，融合效應(yīng)差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50%濃度，pH偏堿時融合效應(yīng)最高。也有采用30%50%濃度的PEG加上10%二甲亞砜。不同批號的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時必須注意。每批都必須進行細胞毒性試驗后方可應(yīng)用。要買高純度的，一般選供 氣相色譜用的 PEG。3. 融合過程融合的方法很多，常用的有轉(zhuǎn)動法和離心法。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。三、細胞融合關(guān)鍵A .技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。B.融合試驗最

10、大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個無毒無菌的操作環(huán)境。4. 雜交瘤細胞克隆化的細胞可以在體外進行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細胞具 有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無胸腺的裸鼠），雜交瘤細胞就開始無限地繁殖， 直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細胞分泌 的單克隆抗體，這種抗體的效價往往高于培養(yǎng)細胞上清液的1001000倍。利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石

11、蠟、抗淋巴細胞血清等，可以加速和促進 腫瘤的生長。單抗的特異性鑒定可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等，同時還需做免疫阻斷試驗等。單抗的效價測定可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同。培養(yǎng)上清液的效價遠不如腹水的效價。采用凝集反應(yīng)，腹水效價可達5 X104。而采用 ELISA檢查，腹水效價可達1.0 X106。單抗的效價以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示。必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。五、單克隆抗體克隆化方法經(jīng)過抗體測定的陽性孔，可以擴大培養(yǎng)，進行克隆，以得到單個細胞的后代分 泌單克隆抗體?？寺〉臅r間一般說來越早越好

12、。因為在這個時期各種雜交瘤細 胞同時旺盛生長，互相爭奪營養(yǎng)和空間，而產(chǎn)生指定抗體的細胞有被淹沒和淘 汰的可能。但克隆時間也不宜太早，太早細胞性狀不穩(wěn)定，數(shù)量少也易丟失?？寺』年栃噪s交瘤細胞，經(jīng)過一段時期培養(yǎng)之后，也還會因為細胞突變或特定染色體的丟失，使部分細胞喪失產(chǎn)生抗體的能力，所以需要再次或多次克隆化培養(yǎng)?？寺』螖?shù)的多少由分泌能力強弱和抗原的免疫性強弱而決定。一般說，免疫性強的抗原克隆次數(shù)可少一些，但至少要35次克隆才能穩(wěn)定。克隆化的方法很多，包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活分單克隆抗體問世以來，由于其獨有的特征已迅速應(yīng)用于醫(yī)學(xué)很多領(lǐng)域。主要表 現(xiàn)在以下幾個方面。1 檢

13、驗醫(yī)學(xué)診斷試劑作為檢驗醫(yī)學(xué)實驗室的診斷試劑，單克隆抗體以其特異性強、純度高、均一性 好等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗、放射免疫分析、免疫組化和流式細 胞儀等技術(shù)。并且單克隆抗體的應(yīng)用， 很大程度上促進了商品化試劑盒的發(fā)展。 應(yīng)用單克隆抗體制作的商品化試劑盒廣泛應(yīng)用于： 病原微生物抗原、抗體的檢測； 腫瘤抗原的檢測； 免疫細胞及其亞群的的檢測； 激素測定； 細胞因子的測定。單克隆抗體對抗原的識別，與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因使用的單克隆抗體不同，識別抗原的位點不同，導(dǎo)致檢測結(jié)果有一定差異。因此，標準化問題還需要進一步研究。2 蛋白質(zhì)的提純單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗

14、體吸附在一個惰性的固相基質(zhì)(如Speharose 2B、4B、6B等)上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱 時，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之 結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。3. 腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù)將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療藥物或放療物質(zhì)連接，利用單克隆抗體的導(dǎo)向作用，將藥物或放療物質(zhì)攜帶至靶器官，直接殺傷靶細胞，稱為腫瘤 導(dǎo)向治療。另外，將放射性標記物與單克隆抗體連接，注入患者體內(nèi)可進行放 射免疫顯像，協(xié)助腫瘤的診斷。單克隆抗體主要為鼠源性抗體，異種動物血清 可引起人體過敏反應(yīng)。因此，制備人-人單克隆抗體或人源化抗體更為重要，但此方面仍未取得明顯進展。七、性1.單克隆抗體的優(yōu)點(1) 雜交瘤可以在體外“永久”地存活并傳代，只要不發(fā)生細胞株的基因突變，就可以不斷地生產(chǎn)高特異性、高均一性的抗體。(2) 可以用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。由于可能得